Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) Questa tecnica analitica è da ormai 50 anni la più utilizzata nel campo della caratterizzazione della struttura di sostanze organiche; ha buone potenzialità anche in campo inorganico Le caratteristiche tecniche dell’NMR ne fanno però uno strumento da ricerca più che da laboratorio, per quanto alcune applicazioni siano entrate nella routine, per esempio nell’ambito del controllo in campo alimentare La tecnica si basa sull’interazione tra atomi aventi numero di spin non nullo posti in un campo magnetico, e una radiazione elettromagnetica nel campo delle radiofrequenze

Spettroscopia NMR interazione tra la componente magnetica del campo elettromagnetico associato ad una radiazione incidente sul campione ed i nuclei magnetici (1H, 13C, 15N, 31P) contenuti nel campione immerso in un campo magnetico esterno

Tutti i nuclei hanno una massa e una carica Tutti i nuclei hanno una massa e una carica. Quelli che hanno il numero di massa oppure il numero atomico, o entrambi dispari, posseggono un momento angolare ossia uno “spin”. La risonanza magnetica è un fenomeno completamente differente dalla “teoria della risonanza”. Qualunque nucleo che possegga uno spin può essere studiato con l’NMR. Il nucleo dell’idrogeno 1H è quello che fornisce il maggior numero di informazioni, mentre l’isotopo più comune del del carbonio 12C non compare nello spettro NMR perché non ha uno spin nucleare.

Lo spin nucleare Lo spin è una proprietà fondamentale come la carica e la massa. Protoni, elettroni e neutroni possiedono uno spin. Molti nuclei atomici si comportano come delle particelle cariche che ruotano intorno al proprio asse. Il momento angolare o momento di spin P che ne risulta è ovviamente quantizzato. P = P è un vettore orientato lungo l’asse della rotazione, e il numero di spin I è un indice dell’intensità (o modulo) di questo momento angolare. I= numero di spin valori=0, ½, 1, e così via fino a 6.

Momento magnetico nucleare Poiché il nucleo atomico è carico, e ogni carica in movimento genera un campo magnetico, ogni nucleo dotato di spin si comporterà come un piccolo magnete, cioè sarà dotato di un momento magnetico m. Il momento magnetico m è proporzionale al momento di spin e ne ha la stessa direzione: quindi il suo modulo non può variare, e può assumere solo due possibili orientazioni per un nucleo con I = ½. La costante di proporzionalità tra il momento magnetico m ed il momento angolare nucleare P è detta costante giromagnetica m m = g P + m g= rapporto giromagnetico mz = g Pz = m g

Nuclei e numeri di spin Alcuni esempi di specie con numero di spin nullo o non nullo sono riportate nella tabella seguente Numero di protoni di neutroni di Spin Esempi pari 12C, 16O, 32S dispari 1/2 1H, 19F, 31P 3/2 11B,35Cl, 79Br 13C 127I 5/2 17O 1 2H, 14N NMR-attivo no si

Come funziona uno spettrometro NMR? Quando un composto contenente idrogeno è introdotto in un forte campo magnetico ed è irradiato con una radiazione elettromagnetica, i nuclei di idrogeno assorbono energia. Naturalmente, come tutti i fenomeni che avvengono su scala atomica, anche questo assorbimento è quantizzato e si verifica solo quando la forza del campo magnetico e la frequenza della radiazione non raggiungono determinati valori. Gli spettrometri NMR sono in grado di misurare tale assorbimento. Uno spettrometro è costituito da un magnete molto potente ed è in grado di generare un campo di radiofrequenze mediante il passaggio di corrente elettrica in una bobina avvolta intorno al campione.

Lo spettrometro Uno spettrometro NMR è formato da alcuni componenti fondamentali: un magnete, che deve produrre un intenso ed uniforme campo magnetico nel quale deve essere posto il campione un generatore di radiofrequenza un ricevitore di radiofrequenza.

Schema di uno spettrometro NMR

Per ottenere lo spettro NMR si colloca il campione all’interno dello strumento e lo si irradia con energia elettromagnetica di frequenza costante: la grandezza che varia è l’intensità del campo magnetico. Quando il campo magnetico raggiunge l’intensità appropriata, i nuclei entrano in risonanza (cioè assorbono energia). Questo fenomeno genera una debole corrente elettrica che viene amplificata e trasformata in un segnale su di un foglio di carta calibrata. Uno spettro NMR è dato dalla registrazione del voltaggio indotto in funzione della variazione del campo magnetico. L’area sotto il picco dipende dal numero totale di nuclei che hanno compiuto il salto.

Magnet giving the currently highest field (18T, 800MHz, 1H resonance frequency) Courtesy of Oxford Instruments Ltd.

Effetto di un campo magnetico esterno (per I=1/2) Nello stato fondamentale tutti gli spin nucleari sono disordinati e non ci sono differenze di energia. Applicando un forte campo magnetico esterno, gli spin si allineano con esso. In questo stato c’è sempre un piccolo eccesso di nuclei allineati nella direzione del campo applicato.

 Spin-spin coupling Livelli energetici Beff = B0 + Blocale Il campo magnetico esterno (B0) crea una differenza di energia tra i nuclei allineati nelle due direzioni: DE = hn0 (risonanza di spin). L’intorno chimico influenza il campo magnetico effettivo presente su ogni nucleo, e quindi anche la DE = hn0: Beff = B0 + Blocale  Chemical shift  Spin-spin coupling Gli spin nucleari, inoltre, interagiscono magneticamente l’uno con l’altro:

Il chemical shift B= B0 (1-s) Sotto l’influenza del campo magnetico esterno gli elettroni tendono ad assumere un movimento rotatorio, e ruotando generano essi stessi un campo magnetico. Nonostante tutti i nuclei di una certo tipo (per esempio 1H) siano esattamente identici, essi risuonano a frequenze leggermente diverse purchè si trovino in intorni chimici differenti. Il campo magnetico generato si oppone al campo magnetico esterno nella zona centrale dell’orbitale, mentre si somma nella sua periferia. Poiché il nucleo si trova al centro dell’atomo, esso sarà sottoposto ad un campo magnetico effettivo minore di quello applicato, è cioè schermato dagli elettroni. B= B0 (1-s)

Misura del chemical shift Dipende dal campo Indipendente dalle condizioni sperimentali Perché il TMS? dodici protoni equivalenti e molto schermati solubile nella maggior parte dei solventi organici facilmente allontanabile

Il chemical shift protonico d- d+ C H Cl Elemento elettronegativo Il principale fattore che dermina il chemical shift di un protone è la densità elettronica del relativo idrogeno. Composto CH3X CH3F CH3OH CH3Cl CH3Br CH3I CH4 (CH3)4Si Elemento X F O Cl Br I H Si Elettronegatività of X 4.0 3.5 3.1 2.8 2.5 2.1 1.8 Chemical shift d 4.26 3.40 3.05 2.68 2.16 0.23 0 TMS Più deschermati Il potere deschermante aumenta con l’elettronegatività di X

CHEMICAL SHIFTS (ppm) R-CH3 0.7 - 1.3 R-C=C-C-H 1.6 - 2.6 R-C-C-H 2.1 - 2.4 O RO-C-C-H 2.1 - 2.5 HO-C-C-H 2.1 - 2.5 N C-C-H 2.1 - 3.0 R-C C-C-H 2.1 - 3.0 C-H 2.3 - 2.7 R-N-C-H 2.2 - 2.9 R-S-C-H 2.0 - 3.0 I-C-H 2.0 - 4.0 Br-C-H 2.7 - 4.1 Cl-C-H 3.1 - 4.1 RO-C-H 3.2 - 3.8 HO-C-H 3.2 - 3.8 R-C-O-C-H 3.5 - 4.8 R-C=C-H H 6.5 - 8.0 R-C-H 9.0 - 10.0 R-C-O-H 11.0 - 12.0 O2N-C-H 4.1 - 4.3 F-C-H 4.2 - 4.8 R3CH 1.4 - 1.7 R-CH2-R 1.2 - 1.4 4.5 - 6.5 R-N-H 0.5 - 4.0 Ar-N-H 3.0 - 5.0 R-S-H R-O-H 0.5 - 5.0 Ar-O-H 4.0 - 7.0 R-C-N-H 5.0 - 9.0 1.0 - 4.0 R-C C-H 1.7 - 2.7

NMR ad onda continua Per ottenere lo spettro NMR si può: variare con continuità la frequenza della radiazione elettromagnetica e misurare l’assorbimento per ogni frequenza (scansione della frequenza) lasciare costante la frequenza della radiazione elettromagnetica e variare con continuità il campo magnetico (scansione del campo): all’aumentare del campo magnetico entreranno in risonanza protoni via via più schermati, e si otterrà comunque uno spettro.

NMR a impulsi (n1 ..... nn) n2 n1 n3 N S RF a banda larga Contiene un intervallo di frequenze RF a banda larga Con un singolo impulso sono eccitati simultaneamente tutti i protoni N S n1 n2 n3 (n1 ..... nn)

Schema generale di un esperimento NMR Il campione è posto in un campo magnetico B L’invio di un impulso elettromagnetico perturba l’equilibrio La precessione della magnetizzazione genera un segnale elettrico noto come FID (Free Induction Decay) Il FID è registrato, e quindi trasformato di Fourier, nel dominio della frequenza: FID(t) →  ()

FREE INDUCTION DECAY ( rilassamento ) Ogni nucleo emette una radiazione alla propria frequenza di risonanza, per cui quello che si ottiene è una sovrapposizione di onde sinusoidali a diverse frequenze.

FID totale spettro nel “dominio de tempo” n1 + n2 + n3 + ...... tempo

TRASFORMATA DI FOURIER Il complesso segnale del FID è trasformato nello spettro NMR attraverso complesse operazioni matematiche DOMINIO DEL TEMPO Convertito in DOMINIO DELLE FREQUENZE FID SPETTRO NMR FT-NMR SEGNALE COMPLESSO n1 + n2 + n3 + ...... Frequenze individuali Un insieme di frequenze che decadono nel tempo Spettro NMR

Il FID è trasformato in un classico spettro NMR spettro nel “dominio delle fequenze”

Spettroscopia NMR  Permette di distinguere i diversi nuclei atomici sulla base delle loro proprietà magnetiche mediate dall’intorno chimico.  Permette di misurare distanze inter-protoniche.  Permette di misurare gli angoli diedri dei legami covalenti.

Acetato di benzile 55 : 22 : 33 = 5 : 2 : 3 Linea integrale L’altezza delle linee integrali è proporzionale al numero di H di ciascun picco 55 : 22 : 33 = 5 : 2 : 3 Linea integrale

Integrazione L’intensità di un segnale nello spettro NMR è proporzionale al numero di protoni che lo genera.

La frequenza di risonanza di HA dipende dagli stati di spin dei nuclei vicini Allineato con B0 Opposto a Bo +1/2 -1/2 50 % di molecole 50 % di molecole H H H H A A C C C C Bo doppietto

La costante di accoppiamento La distanza (= differenza di frequenza) tra i due segnali del doppietto (di solito detti rami del doppietto) è detta costante di accopiamento ed indicata col simbolo J. Il chemical shift del protone che dà origine al doppietto è misurato al centro del doppietto.

L’ accoppiamento spin-spin è dovuto alle interazioni tra i momenti magnetici nucleari, che sono indipendenti dal campo magnetico applicato B0 per cui le costanti di accoppiamento J sono indipendenti dal campo magnetico applicato e risultano uguali in qualunque spettrometro. Si misurano in Hz e non in ppm. 60 MHz L’ aspetto dello spettro varia al variare del campo dello spettrometro 200 MHz 600 MHz

La regola n+1 singletti doppietti tripletti quartetti quintetti Per prevedere la molteplicità singletti doppietti tripletti quartetti quintetti sestetti septetti Due nuclei vicini n+1 = 3 tripletto Un nucleo vicino n+1 = 2 doppietto

( x = y ) ( x = y )

Il triangolo di Tartaglia Intensità delle linee del multipletto 1 singletto 1 1 doppietto 1 2 1 tripletto 1 3 3 1 quartetto 1 4 6 4 1 quintetto 1 5 10 10 5 1 sestetto 1 6 15 20 15 6 1 eptetto 1 7 21 35 35 21 7 1 ottetto

Spettro NMR del Bromoetano

Spettro NMR dell'acetaldeide

Spettro NMR del 2-nitropropano

Costante di accoppiamento long-range. Accoppiamento allilico (4J: CH-C=CH): J  0-2 Hz Accoppiamento omoallilico (5J: CH-C=C-CH): J  0-2 Hz Accoppiamenti meta e para in composti aromatici: Jmeta  1-3 Hz Jpara  0-1 Hz Accoppiamento W: 4J  0-7 Hz

Protoni equivalenti Molto spesso i protoni possono risuonare alla stessa frequenza perché si trovano nello stesso intorno chimico, ossia perché sono equivalenti: per simmetria per rotazione libera

NMR monodimensionale FID = Free Induction Decay La FT-NMR monodimensionale rivela i chemical shift di tutti i nuclei presenti nel campione

Altri esempi di spettri NMR-1H monodimensionali Cellulasi (36 residui) Etanolo

Advantages Can be performed in aqueous solutions under in vivo conditions Does not rely on specific reporter groups or artificially attached dyes Don’t need to crystallize the protein Large array of parameters can be extracted from the resonance lines -         all NMR measurements can be performed in aqueous solutions under conditions that are close to the physiological conditions in which the protein exists (in vivo) -         does not rely on specific reporter groups (ie. aromatic side chains on residues) or artificially attached dyes o       essentially every single atom can be observable via its resonance line in the spectrum as a result – the entire protein can be monitored in a direct manner without substantial intervening calculations -         don’t need to crystallize the proteins o       many proteins can’t be crystallized many detailed features of protein structure in the crystal state can be distorted by crystal packing interactions and the presence of high concentrations of cosolvents needed to induce crystallization o         o       -         large array of parameters can be extracted from resonance lines o       ID and characterization of ligand interactions o       Mapping of ligand-binding surfaces o       Elucidation of polypeptide folding pathways o       Determination of the 3D molecular solution structure and a description of the 3-D molecular solution structure o       Description of its dynamic properties on time-scales o       exploited to get the 3-D structure of proteins and the nature of their interactions with other molecules, as well as biological function and dynamic properties.

Problems Overcrowded spectra Limited space available in spectrum Typical width of resonance line is larger for a protein than a polypeptide so the peak height is decreased (decreases sensitivity) Limited to small proteins (less than 150 residues) -         over crowded spectra o       every single atom in a protein has the potential to generate an NMR signal (ie. a 100 aa can yield about 1000 proton NMR lines) -         limited space available in the spectrum o       limits peak resolution so the spectral bandwidth available for the signals is limited and there is overlap -         typical width of resonance line is larger for protein than the peptide thus the peak height is decreased o       more overlap o       decreases sensitivity (S/N ratio: ratio of signal height to the level of noise generated from the experiment)  

H1 NMR spectrum of lysozyme The NMR spectrum of lysozyme at pH 4.0, 58ºC H1 NMR spectrum of lysozyme Proteins have many hydrogens and therefore many peaks. The peaks seen are very sharp because nucleii tend to stay in their excited state for a relatively long time, (it is a spectroscopic principle that the linewidth of an absorption line is inversely proportional to the lifetime of the excited state) but with proteins there can easily be so many peaks in some regions of the spectrum that they cannot be resolved. Remember that, on average, each amino acid has eight hydrogens. Technological development in superconducting magnets result in progressively increased magnetic field strength, with accompanying increases in inherent spatial resolution and sensitivity. As you can see from the spectrum of lysozyme (a relatively small protein at only 14.6kDa) the NMR spectrum of a protein is very complex and contains many signals, some of which will overlap, because many protons are in very similar environments. In order to solve the structure of a protein, more complex NMR methods are needed. In effect, these methods allow (i) the NMR spectrum to be assigned (i.e. every signal in the spectrum identified in terms of the proton in the protein) and (ii) a family of distance constraints between pairs of spatially proximal protons in the structure to be collected, from which a structure is calculated.

NMR-Bidimensionale Gli spettri protonici e 13C sono grafici a due dimensioni che riportano il c. s in funzione dell’intensità del segnale. Tuttavia li si definisce esperimenti monodimensionali in quanto esiste una sola variabile indipendente rappresentata dalla frequenza che deriva dall’ FT del FID. Nelle tecniche monodimensionali classiche la sequenza degli eventi è la seguente: Nelle tecniche bidimensionali si introduce, dopo l’impulso e prima dell’acquisizione un periodo di evoluzione variabile t1. Ciascun FID sarà quindi funzioni di due variabili di tempo t1 e t2

In pratica però i FID ottenuti sono sottoposti a due serie di trasformate di FT nei due domini di tempo sfasate di 90°. Avremo quindi un esperimento in due dimensioni n1 e n2

Tipi di esperimenti bidimensionali Esperimenti omonucleari 2D-COSY (1H-1H scalare) HOHAHA (1H-1H scalare) NOESY (1H-1H dipolare) Esperimenti eteronucleri HMQC (1H-13C diretta, 1J) HMBC (1H-13C long-range, 2J, 3J)

Rappresentazione schematica di uno spettro NMR 2D di due spin A e B fra loro interagenti w1 w2

2-D spectra COSY 1H NMR for a 17res protein If the peaks on the diagonal were plotted along the diagonal line, the 1D spectra would also be shown Off-diagonal peaks show when a spin-spin interaction occurs between two protons Rubinson and Rubinson. Contemporary Instrumental Analysis. Prentice Hall: New Jersey, 2000.

Structure Assignment Intraresidual coupling Interresidual coupling The aim of the analysis of NMR spectra is to extract all available information about interatomic distances and torsion angles. In the initial stage of investigation by NMR spectroscopy each resonance must be associated with a specific nucleus in the investigated molecule. This process is called assignment. The strategies employed for the assignment procedure depend on whether only homonuclear 2D spectra are available (unlabelled proteins), whether 15N heteronuclear spectra are available (15N labelled proteins) or whether triple resonance spectra (15N/13C doubly labelled proteins) are available. But in general the assignment can be divided in two parts: The sequential assignment of the amino acids in the protein sequence and the assignment of the amino acid side chains. As well as NH to NH or CH-alpha interactions, NOESY spectra show the interactions of any proton with any other proton that may be far away in the primary sequence of the protein, but is close in 3D space. Sequential assignment effectively assigns the NMR spectrum of a protein (determines which peak corresponds to which proton), and the additional data of the NOESY spectrum allows determination of the 3D structure by giving a large set of constraints on the possible distances between certain protons. As the diagram above shows, NOESY can jump from NH to CH-alpha, and under some circumstances, also from NH to NH. We always see a signal for the NH to CH-alpha correlation; in alpha helices, additional signals for NH to NH interactions are seen because they are close in space. The two possibilities give distinct fingerprints on a NOESY spectrum, which allows identification of elements of secondary structure. For example, in alpha helices, peptide NH groups are brought close together so we see lots of off-diagonal peaks in the NH region of the spectrum. All the data gained from COSY and NOESY experiments is fed into a computer, which calculates a set of possible structures that all satisfy the distance constraints. The results are sometimes shown with 10 or 20 of these possible structures overlayed, like the diagram below which shows the structure of the C-terminal domain of a cellulase, which was calculated from the 2D NOESY spectrum above. Interresidual coupling

Schema di una interazione “through-space” e del suo relativo spettro 2D-NOESY

Esempio reale di spettro NOESY

Informazioni derivanti da spettri NMR NOESY (a) Mediante spettri NOESY possono essere identificati i residui adiacenti nella sequenza in una proteina. (b) Gli spettri NOESY identificano anche gli atomi di H di residui non adiacenti nella struttura primaria che interagiscono in regioni di struttura secondaria.

Struttura tridimensionale del dominio C-terminale della cellulasi derivante dallo spettro bidimensionale visto precedentemente