Agenti chimici Agenti fisici Agenti biologici PROTONCOGENI (Gene normale) altamente conservati nelle varie specie nel corso dell’evoluzione i loro prodotti esplicano funzioni essenziali ONCOGENI geni capaci di indurre lo sviluppo di un tumore producono proteine abnormi nella struttura e nella funzione

contribuisce alla cancerogenesi Oncogene Qualsiasi gene che con guadagno di funzione contribuisce alla cancerogenesi Dominanti

con la perdita di funzione contribuisce alla cancerogenesi Gene oncosoppressore Qualunque gene che con la perdita di funzione contribuisce alla cancerogenesi Recessivi

Progressione neoplastica Immortalizzazione Trasformazione Progressione neoplastica

Proto-oncogeni Oncogeni Alterata struttura Alterata regolazione Proto-oncogeni Oncogeni

Oncogeni 1911-Peyton Rous discovers a “filterable agent” in extracts of chicken tumors that can induce new tumors when injected into otherwise normal chickens. (Nobel Prize) Filterable substance is later identified as a virus that had an RNA genome instead of DNA and is thus termed a “retrovirus”. Retroviruses have three basic genes: Group Antigen Gene (GAG), nucleo-capside a special Polymerase (POL), RT and viral envelop proteins (ENV).

Oncogeni DNA RNA 1970-Temin and Baltimore discovered that the POL enzyme can “reverse-transcribe” or direct DNA synthesis from an RNA template (Nobel Prize). Two types of the retroviruses identified: transforming and non-transforming. 1970-Isolation of an additional genetic element termed SRC from transforming Rous sarcoma viruses that is directly responsible for causing cancer (an oncogene).

Ciclo vitale del Virus del Sarcoma di Rous che contiene l’oncogene src

L’oncogene src codifica per una proteina di pm 60000 è una protein-chinasi Ha un’attività enzimatica che attaccava ioni fosfato agli aminoacidi di altre proteine substrato, in particolare alla tirosina (generalmente la fosforilazione avviene in treo e ser)

Le sequenze virali:v-onc furono identificate non solo nel pollo ma anche in altre specie filogeneticamente lontane

Oncogeni 1976-Varmus and Bishop discovered that normal cells contain a homolog of the oncogene v-src. Thus, all normal cells contain potential cancer causing genes (Nobel Prize). All v-onc genes have normal cellular homologs. 1983-Hanafusa elucidated the mechanism by which normal cellular oncogenes are acquired by retroviruses. v-onc c-onc

Gli oncogèni sono presenti in tutte le cellule normali, necessariamente essi devono servire a funzioni estremamente importanti e fondamentali Pertanto i virus oncogeni non erano più da considerarsi entità biologiche comparse prima delle cellule eucariotiche, ma al contrario dovevano costituire una forma biologica evolutasi successivamente, per favorire lo scambio di informazioni genetiche tra diverse specie animali e vegetali (Dulbecco 1984).

Durante l’evoluzione alcuni retrovirus privi di v-onc hanno acquisito tali geni dalle loro cellule ospiti per ricombinazione genica durante la replicazione virale Gli stessi retrovirus possono poi reintrodurli nelle cellule ospiti infettate v-onc

Cenni di cancerogenesi virale Retrovirus lenti C-myc Ltr del virus codifica per i prodotti virali che vanno a controllare in modo anomalo funzioni essenziale della cellula Retrovirus trsformanti acuti V-onc

Oncogeni 1982-Weinburg transforms mouse fibroblasts with human DNA derived from bladder carcinoma cells. Those cells that become transformed have a human gene homologous to v-ras. First demonstration that an oncogene can cause human cancer. Over 50 oncogenes and proto-oncogenes have been identified by studying oncogenic viruses and transforming genes from human and animal tumors.

Oncogeni non virali nei tumori c-onc senza v-onc Studi ulteriori hanno dimostrato la presenza nelle cellule normali di: Oncogeni non virali nei tumori Esistono nel genoma umano protooncogeni mai trasferiti a retrovirus Questi geni sono presenti nelle cellule tumorali Amplificati o Mutati

Sono proprio i protooncogeni alterati la causa della trasformazione neoplastica?

Gli oncogeni sono dotati di potere trasformante derivano da protoncogeni che hanno subito mutazioni

Geni per l’immortalizzazione Geni per l’apoptosi Geni per il controllo dell’angiogenesi Geni per l’invasività Geni per le metastasi Geni per favorire l’accumulo di mutazioni

Come vengono attivati gli oncogeni?

Le mutazioni avvengono: nelle sequenze regolatorie o in quelle codificanti

Meccanismi di attivazione degli oncogeni e loro effetti sull’espressione genica Eccesso dose

CANCRO Alterazioni genetiche... Meccanismi di riparazione del DNA Oncogeni Geni oncosoppressori Deletione Mutatione inattivante Ipermetilazione Amplificatione genica Overexpressione genica Mutatione attivante CANCRO ...oppure Alterazioni epigenetiche Ipermetilazione dei promoter

Un oncogene può essere attivato per: Mutazione Amplifivazione genica Traslocazione cromosomica Infezione virale

Un retrovirus può convertire un proto-oncogene a un oncogene alterando le sequenze geniche La proteina codificata avrà un’attività abnorme Un proto-oncogene può diventare oncogene quando è spostato sotto il controllo di promoter o enhancer del genoma virale

Funzione delle oncoproteine Virus oncogeni a DNA Funzione delle oncoproteine

a carico di un protoncogene Mutazioni puntiformi a carico di un protoncogene Es: ras

Gene RAS Modello dell'attività Proliferazione Mutazioni puntiformi dei geni della famiglia RAS sono l’anomalia singola più comune di oncogeni trasmesse come caratteri autosomici domananti nei tumori umani (15-20%)

Meccanismi di amplificazione degli oncogeni Nelle cellule tumorali possono essere presenti molte copie dello stesso gene sia geni normali sia geni mutati C-myc microcitoma N-myc neuroblastoma

Traslocazioni cromosomiche Trasferimento di un frammento di cromosoma Tumori mesenchimali (Recombinasi) Traslocazione c-myc Controllo ciclo cellulare alterato Linfoma di Burkitt traslocazione di c-myc -t (8,14) (90% dei casi) -t (8,2) -t (8, 22)

Traslocazioni cromosomiche Leucemia linfoide acuta a cell T Traslocazione (8.14) della catena α del TCR in contatto con c-myc

Traslocazioni cromosomiche Inserzione del gene trasferito sul sito di un altro gene Gene ibrido Prodotto abnorme Leucemia mieloide cronica t(9,22) (q34, q11) Il protooncogene abl viene traslocato e fuso in un sito bcr (Breackpoint Cluster Region) Il prodotto bcr/abl è una proteina p210 con una potente attività tirosinchinasica

Inversione cromosomica Leucemia mielomonocitica acuta, unv 16 (p16,q22) Leucemia mieloide acuta Inv 3 (q21,q26) Linfomi a cell T Inv 14 (q11,q32)

Sono ereditati dalle cellule figlie Eventi epigenetici: Sono ereditati dalle cellule figlie ma non sono dovuti ad alterazione dell’informazione genetica Attività telomerasica Siti fragili Instabilità cromosomica di alcune regioni ricche di CGG O CCG Metilazione

Funzioni degli oncogeni

Classi di oncogeni raggruppati in funzione dei prodotti codificati Fattori di crescita Recettori per fattori di crescita Fattori di trascrizione Fattori di trasduzione Regolatori dell'apoptosi

Oncogeni che codificano per fattori di crescita Possono agire singolarmente o in sinergia Alcuni sono segnali negativi Proteine aberranti con omologie con i GF Eccesso di GF Innesco di un meccanismo autocrino di stimolazione alla proliferazione Es: p28 sis omologo PDGF Cellule (coinvolte nella riparazione dei tessuti: fibroblasti, endoteliociti, c muscolari lisce) con recettori per il PDGF continuamente stimolate Glioblastomi producono PDGF e rec PDGF Sarcoma:Scimmia, gatto Spesso altri oncogeni inducono iperespressione (ras) di GF e rec GF

Alterata espressione del recettore per un fattore di crescita Le cellule mostrano un elevato n° di recettori per amplificazione oppure possono mostrare recettori strutturalmente e funzionalmente aberranti GUADAGNO DI FUNZIONE

Recettori Tirosinchinasici: poco espressi nelle cellule normali AEV erb-b recettore troncato dell’EGF AEV erb-a recettore per l’ormone tiroideo Sarcoma felino v-fms forma del rec di MCSF Sarcoma felini v-kit forme attiva del rec per Stem Cell Factor

Monoclonali che contrastano ERB B1, gene normalke del EGFR è iperespresso: 80% del ca squamocellulare del polmone, 50% glioblastomi, 80-100% t. testa-collo ERB B2, HER-2/NEU è amplificato: 25% ca mammella e ovaio, polmone, stomaco e ghiandole salivari Monoclonali che contrastano l’attività di EGFR CETUXIMAB ERLOTINIB GEFINITIB

MEN-2B MEN-2B RET è normalmente espresso nelle c neuroendocrine e interagisce con il fattore neurotrofico derivato dalle c gliale promuovendo la sopravvivenza cellulare durante lo sviluppo neuronale RET è normalmente espresso in cellule neuroendocrine: CelluleC parafollicolari della tiroide Cellule della Midollare del Surrene Cellule parafollicolari Mutazione del recettore ret trasmessa per via germinale Carattere autosomico dominante Neoplasie del sistema endocrino MEN-2B MEN-2A: ca midollare della tiroide, surrene e paratiroidi MEN-2B: ca tiroide e surrene MEN-2B

Proteina di trasduzione 1.Interazione ligando-recettore 2. Riorganizzazione del recettore e autofosforilazione delle strutture intracitoplasmatiche 3. Interazione con proteine citoplasmatiche 4. Messaggio nel nucleo Oncogeni codificano: Proteine leganti la guanosina trifosfato e Protein chinasi di tipo non recettoriale

Proteine G eterotrimeriche legano nucleotidi guanilici

Ras- mutato legano GPT più a lungo diversa attività GTPasica Mutazioni ras ubiquitarie nei tumori solidi, linfoidi e mieloidi K-ras: sarcoma murino indotto dal virus di Kirsten H-ras: sarcoma murino indotto dal virus di Harvey N-ras: neuroblastomi e carcinomi presenti anche nell’uomo Riduzione dell’attività GTPasica Le mutazioni di ras si manifestano Facilitazione del distacco di GDP Alcuni tumori hanno mutazioni in proteine presenti sulla via di ras Le proteine di ras fungono da mediatori tra i recettori per i GF e gli effettori mitogenici coinvolti a valle nella proliferazione e nel differenziamento cellulare

Ras mutato o alterazioni a monte Mutazioni dei geni ras sono coinvolti nel processo di iniziazione della cancerogenesi Modello di cancerogenesi di Beremblum Ras mutato o alterazioni a monte si riscontrano nel 15-20% dei tumori umani 90% adenocarcinomi e colangiocarcinomi del pancreas 50% ca colon, endometrio e tiroide 30% adenocarcinomi del polmone e leucemie mieloidi

Tumori umani Oncogeni RAS Le proteine ras sono un componente essenziale nei meccanismi di segnale tra i recettori per i fattori di crescita e i loro effettori. I geni della famiglia ras codificano per proteine ad alta omologia Le proteine di ras sono delle proteine G, piccole GTPasi Controllano meccanismi molecolari molto complessi Mutazioni di ras sono state evidenziate in numerosi tipi di tumore

I geni della famiglia ras Nell’uomo sono stati isolati tre geni altamente omologhi . Hras, Kras e Nras che codificano per tre proteine di PM21kDa Le tre isoforme correlano in modo diverso con le varie neoplasie e con la prognosi Alcune mutazioni di queste isoforme ricorrono più frequentemente nei diversi tumori

Proteinchinasi citoplasmatiche L’attività tirosin-chinasica nelle cellule normali è scarsa L’aumento di fosfotirosina è un marker di malignità Substrati di proteine con attività tirosichinasica possono essere: Enzimi Proteine di trasporto Proteine del citoscheletro Proteine di adesione Fattori di trascrizione

Riarrangiamento e attivazione dell’attività chinasica Pp60del virus sarcoma di Rous Sito di regolazione Delezione Tyr527 Riarrangiamento e attivazione dell’attività chinasica

Fattore di trascrizione Fattori che controllano direttamente la regolazione di geni, legando specifiche sequenze di DNA

Traslocazioni cromosomiche attivano fattori di trascrizione Activator Protein 1 (AP-1) È un fattore di trascrizione costituito da fos e jun Regolato da una serie di fattori: citochine. fattori di crescita, stress, infezioni batteriche e virali Controlla numerose funzioni cellulari: proliferazione, differenziazione e apoptosi jun fos Traslocazioni cromosomiche attivano fattori di trascrizione

c-myc appartiene ad una famiglia di geni: MYC è espresso in tutte le cellule eucariote, viene attivato quando le cellule quiescenti ricevono un segnale di divisione Attività modulate da MYC: Acetilazione degli istoni, riduzione adesione cellulare, aumento motilità cellulare, aumento telomerasi, aumento sintesi proteica Apoptosi c-myc appartiene ad una famiglia di geni: N-myc (neuroblastoma)e L-myc(microcitoma) Come fattore di trascrizione funziona da repressore e in alcuni casi da attivatore Splicing alternativo: c-Myc1 e c-Myc2 c-Myc2 Progressione del ciclo cellulare c-Myc1 Morte per apoptosi, quando attivato senza segnali di sopravvivenza

Myc-Max attivatori della trascrizione genica Max-Max inibitori Myc risulta iperespresso in numerose neoplasie maligne: Leucemie, ca del colon, ovaio e polmone, ecc

Cicline e chinasi ciclino-dipendenti CDK fosforilano proteine che guidano il cicli cell CDK I Oltre 15 cicline D E A B CDK I sono spesso mutate o inibite in neoplasie umane: Ca pancreas, glioblastomi, esofago, leucemie, polmone, vescica

Sovrapproduzione di un fattore che previene l’apoptosi

Tumori umani Oncogeni

Sono colpiti da mutazioni inattivanti Oncosoppressori Contrastano lo sviluppo di neoplasie Regolano la proliferazione cellulare Controllano i meccanismi di pausa del ciclo cellulare Avvio ai processi di riparazione del DNA Differenziazione Morte cellulare Sono colpiti da mutazioni inattivanti

Come sono stati identificati i geni oncosoppressori? Esperimenti di fusione cellulare Esperimenti di micronucleazione Analisi del cariotipo delle cellule tumorali Meccanismo oncogeno degli OncoDNA virus

Nelle cellule tumorale i geni oncosoppressori risultano: Perduti Delezione genica Alterati mutazioni Repressi ipermetilazione La mancata funzione dei geni oncosoppressori provoca trasformazione e progressione neoplastica

Geni recessivi?

Caratteristiche del cancro ed oncosoppressori Proliferazione autonoma: Rb, p53. APC, NF1 Resistenza all’apoptosi: P53, PTEN Insensibilità ai segnali di inibizione della crescita: Rb, DPC4 Invasività e metastasi. CDH1 Angiogenesi. VHL Resistenza alla senescenza: Rb, p53

Due eventi mutazionali Processo oncogenetico multifasico : “ teoria dei due colpi “ di Knudson Due eventi mutazionali Un allele del gene oncosoppressore può essere ereditato mutato da uno dei due genitori (eterozigosi), l’altro viene inattivato da un evento mutageno occasionale(omozigosi)

Proteine regolatorie attive in particolari momenti del ciclo cellulare Cicline : Proteine regolatorie attive in particolari momenti del ciclo cellulare How do the cells over come these checkpoints? i.e. the negative controls in resting cells that prevent cell cycle progression? Positive signals like: Hormones (insulin) Growth factors (PDGF) Cytokines (interleukins, IL1-18) Rb e p53

Oncosoppressori: Rb e p53 Espressione genica: Fos, jun, myc Cicline Fattori di crescita (controllo pos): EGF, FGF, PDGF, TGFα IGF I, IGF II Fattori negativi: IFN, TGFβ, TNF Oncosoppressori: Rb e p53 Espressione genica: Fos, jun, myc Cicline

Rb Primo oncosoppressore identificato associato alla comparsa di retinoblastoma

Il retinoblastoma è un tumore raro che colpisce la retina 1 su 20000 tra bambini e neonati 60% sporadico, 40% ereditario

Elevato rischio di osteosarcomi, sarcomi, Retinoblastoma Colpisce i due sessi in età infantile Forma precoce (60%): entro 15 mesi di vita Multifocale, bilaterale, tendenza ad altre neoplasie Forma tardiva (40%): si manifesta tra i 4 e 5 anni Teoria difasica Nella forma precoce la prima mutazione è prezigotica La seconda è casuale Le mutazioni/delezione di Rb è associata a numerose neoplasie umane e animali Elevato rischio di osteosarcomi, sarcomi, ca della mammella, ca a pioccole cellule del polmone e ca della vescica

Fosfoproteina nucleare fondamentale nella regolazione Gene Rb P105 RB Fosfoproteina nucleare fondamentale nella regolazione del ciclo cellulare E’ espressa in tutte le cellule

p105 ipofosforilata lega il fattore E2F blocca il ciclo cellulare p105 iperfosforilata libera il fattore di trascrizionepassa E2F Si complessa con DP1 e passa nel nucleo dove attiva geni indispensabili per la replicazione del DNA e protooncogeni: es myc e myb che determinano l’avanzamento della cellula della fase G1 alla fase S Rb esercita la sua azione modulatrice con intensità diversa nei vari citotipi

è coinvolto nel differenziazione cellulare: Rb è anche coinvolto nell’arresto irreversibile del ciclo della proliferazione: senescenza Rb è coinvolto nel differenziazione cellulare: Regola fattori di trascrizione tessuto-specifici Carcinoma a piccole cellule 90% Carcinoma non a piccole cellule 10-15% Ca prostata 20% Ca mammella10% Ca vescica 20-50% Leucemia mieloide cronica 20% Glioma 15-20% Ca esofago 15-50% Ca fegato 15-30% Mutazioni Rb nei tumori umani sporadici Altri geni possono mimare la funzione diRb

Delezione o legame con proteine virali P105 mutato lascia il fattore E2F continuamente disponibile per la trascrizione genica Come avviene? Delezione o legame con proteine virali p105 iperfosforilato

Proteine virali possono inibire l'azione di oncosoppressori Host cell tumor suppressor protein Viral oncoprotein Simian virus 40 large T antigen p53 E1b Adenovirus E1a Rb E6 Human papillomavirus E7

Il guardiano del genoma p53 Il guardiano del genoma

p53 fosfoproteina nucleare che funziona da fattore trascrizionale in grado di legare sequenze di DNA Controllo della proliferazione Attivano i meccanismi di riparazione al DNA danneggiato Apoptosi

Ipossia Erosione dei telomeri Privazione dei fattori di crescta Attivazione degli oncogeni

E’ attiva come tetramero, anche mutazioni di un solo allele risultano in una p53 inattiva molto più stabile Ha una breve emivita Viene inattivata da MDM2

Interazione con il DNA Interazione con p53 Autoinibizione Attiva geni che inibiscono la progressione del ciclo cellulare e inibisce quelli che ne favoriscono la progressione Il gene mutato perde la capacità di agire come attivatore trascrizionale dei geni coinvolte nel ciclo cellulare Mutazioni e delezioni

mutata è molto frequente nei tumori umani sporadici Ca ovarici ed esofagei 50% Ca colon-retto pancreas e polmone 40-50% Utero e mammella 25-30% Sarcomi15-20% Sindrome di LI Fraumeni: Mutazione germinali di p53 Alto rischio all’insorgenza di: Sarcomi, leucemie, neoplasie alla mammella 30% entro i 30anni 90% dopo i 65 anni

Mutazioni di p53 sono associate ad una ridotta risposta ai chemioterapici e alla radioterapia

Care taker (curatori):