The MITO-16/MANGO-OV2 Project: 9th Progress Report XXVIII^ Riunione Nazionale MITO Mesagne 19 Gennaio 2017 The MITO-16/MANGO-OV2 Project: 9th Progress Report

The MITO 16/MANGO OV2 project PHASE IV prospective study of first-line bevacizumab plus chemotherapy in advanced ovarian cancer patients (IIIB-IV) with translational objectives and conducted only in Italy PHASE III randomised controlled trial on the efficacy of the addition of bevacizumab to second line chemotherapy following first-line treatment including bevacizumab in platinum-sensitive advanced ovarian cancer patients. To be conducted internationally (France, Greece and Switzerland).

MITO 16/MANGO OV2 (a) Phase IV trial Design Ovarian Ca Stage IIIB-IV (FIGO) ECOG 0-2 Availability of samples for translational res. No Beva contraindications No previous treatments Bevacizumab* 15mg/kg Paclitaxel 175mg/m2 Carboplatin AUC 5 q3wks If not PD Bevacizumab* 15 mg/Kg q 3wks 6 cycles 22 cycles *Bevacizumab will be provided by Roche ltd

MITO 16/MANGO OV2 (a) Phase IV trial Figures End of the enrollment: March 2014 400 patients enrolled Number of events (to 18/01/2017): 269 Patients without events: 131 Patients with last FU visit > 6 months: 101 (77%) Patients with last FU visit > 12 months:74 (57%) Patients passed moved to Ph3 without an event (PD) on the Ph4: 16 Events required for the analysis:280

MITO 16/MANGO OV2 (a) Phase IV trial Timeline

MITO 16/MANGO OV2 project: the Phase III trial Ovarian Ca Platinum-sensitive Previous Bevacizumab ECOG 0-2 Availability of samples for translational res. No Beva contraindications R CBDCA AUC5 + PAC 175 mg/m2 q3w or CBDCA AUC4, d1 + GEM 1000mg /m2, d1&8 q3w CBDCA AUC5+PLD 30mg/m2 q4w Plus bevacizumab** 15mg/kg q3w Plus bevacizumab 15mg/kg q3w Plus bevacizumab 10mg/kg q2w ARM 1: 6 cycles ARM 2*: 6 cycles n=400 pts International (MITO, MANGO, ENGOT) *Patients without PD after 6 cycles of combined treatment will receive Bevacizumab maintenance until PD **Bevacizumab will be provided by Roche ltd

MITO 16/MANGO OV2 project: the Phase III trial Primary objective: To test whether the addition of bevacizumab to second-line chemotherapy can prolong progression-free survival (PFS) of platinum sensitive ovarian cancer patients progressing or recurring after a first-line treatment including bevacizumab

The Phase III trial: Enrollment

Enrollment by Group

Arruolamento per braccio di trattamento Chemo BackBone: CBDCA+ ITALY Rest of Europe - Beva +Beva Paclitaxel 16 15 5 6 PLD 69 30 29 Gemcitabina 52 56 83

Centri con campioni da ritirare (85) Center # enrol exp prvd tprv U. O. di Ginecologia Oncologica Dip. di Gin. ed Ostetricia Policlinico Universitario Gemelli Università  Cattolica del Sacro Cuore, Roma 30 21 Istituto Nazionale Tumori Divisione Ginecologia Oncologica, Milano 61 32 17 15 Istituto Europeo di Oncologia UO Ginecologia, Milano 27 14 Oncologia Medica A.O.Garibaldi Nesima, Catania 6 Ospedale Santa Chiara UO di Ostetricia e Ginecologia ad indirizzo Oncologico Universitaria, Pisa 7 4 Istituto Oncologico Veneto IRCCS UOC Oncologia Medica II, Padova 9 1 3 AOU Policlinico Universitario Federico II Oncologia Medica,Napoli 5 2 U.O. di Oncologia, Azienda Ospedaliero Universitaria di Parma Istituto Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori--IRCCS di Meldola Oncologia Medica Meldola (FC) 8 U.O.Oncologia Medica - A.O. Vito Fazzi, Lecce Osp. Manzoni di Lecco, Lecco Ospedale di Sondrio SC Oncologia Medica, Sondrio Oncologia Medica IRCCS San Martino IST, Genova AO U.L.S.S. 13 Mirano UOC Oncologia ed Ematologia Oncologica, Mirano (VE) Div. di Oncologia Medica Osp. S. Vincenzo di Taormina, Taormina (ME) Oncologia Medica - Ospedale S. Giovanni Calibita Fatebenefratelli Div. di Oncologia Medica Centro Oncologico Osp. Civile di Faenza, Faenza (RA) Fondazione del Piemonte per l’ Oncologia - IRCCS Div. di Oncologia,Candiolo (TO) Az. ASL 4 - Ospedale di Prato, Prato (PO) A.O. Ordine Mauriziano,Torino E.O. Ospedali Galliera S.C. Oncologia Medica

Campioni-Resto d’Europa Country # enrol prvd tprv % CH 17 F 100 37 63 63% Gr 11 100% Totale 128 54 74

GRAZIE!!

Stato dell’arte dei campioni MITO 7

MITO 7: sample 158 patients with a sample for IHC 365 patients: from centers with bio study not approved 457 patients ELIGIBLE FOR SAMPLING 281 patients: sample not COLLECTED 176 patients WITH SAMPLE 1 patient: retract consent 12 patients: sample not from diagnosis 163 patients with a sample for revision 5 patients: inadequate block for IHC (1= DIAGNOSI NON COMP, 4= MATERIAL INSUFF) 16 patients: inadequate block (1= DIAGNOSI NON COMP, 15= MATERIAL INSUFF) 11 patients: fixed in bouin 158 patients with a sample for IHC 136 patients with a sample for nucleic acid extraction 126 pz P (49 with M) 31 pz M 1 pz revision ongoing 207 blocks 107 pz P (41 with M) 28 pz M 1 pz revision ongoing 177 blocks

Campioni MITO 7 elegibili per la ricerca traslazionale: CENTER N. Patients elegible N=457 Patients with sample n=176 1 93 66 (71%) 6 1 (100%) 40 9 5 (56%) 43 5 5 (100%) 173 3 3 (100%) 213 2 2 (100%) 219 26 24 (92%) 238 4 (80%) 320 33 (83%) 344 16 14 (88%) 362 1 (33%) 365 19 18 (95%) 38 4  0 101 12 145 131 172 22 182 305 8 335 39 354 363 11 9 centri con 235 pazienti e parere CE positivo NON hanno inviato i blocchetti!!

5 pz: esclusi dalla revisione CENTRO ID PAZIENTE ID 1 196 219 183 244 445 344 670 CENTRO ID PAZIENTE ID 1 397 CENTRO ID PAZIENTE ID 1 6 12 156 168 663 655 43 469 219 38 68 731 365 251 769 1 pz: ritiro consenso 5 pz: esclusi dalla revisione CENTRO ID PAZIENTE ID 1 492 688 40 204 225 25 219 260 320 339 610 137 344 211 12 pz. Chirurgia post chemio CENTRO ID PAZIENTE ID 219 8 13 41 59 108 125 187 205 212 247 259 243 10 pz: biopsie non adeguate per la morfologia 12 pz: biopsie fissate in bouin

Pazienti sicuramente NON utilizzabili per analisi IHC Pazienti sicuramente NON utilizzabili per estrazioni di acidi nucleici CENTRO ID PAZIENTI N=18 1 7 6 43 219 344 365 2 CENTRO ID PAZIENTI N=40 1 9 6 40 3 43 219 19 320 344 2 365

CAMPIONI UTILIZZABILI PER IHC N PAZIENTI con campione utile CENTRO N. Pazienti con sample N PAZIENTI con campione utile N. BLOCC P DI CUI ANCHE M M ? N. BLOCC TMA n. blocc su sez 1 66 59 86 46 27 12 78 8 40 5   4 2 3 43 173 213 219 24 18 19 17 238 320 33 45 6 42 344 14 13 20 7 362 365 16 175 158 207 126 49 31 188

CAMPIONI DI RNA ESTRATTI N PAZIENTI con campione utile CENTRO ID N. Pazienti con sample N PAZIENTI con campione utile N. BLOCC P DI CUI ANCHE M M Under revision 1 66 57 78 41 21 15 40 5 2   43 4 3 173 213 219 24 6 238 320 33 30 26 11 344 14 12 18 362 365 16 175 136 177 107 28

MITO 7: RNA Quality check GE 18 pz/34 cp (19 %) 136 patients with a sample for nucleic acid extraction (RNA completato) 107 P (41 with M) 28 pz M 1 pz revision ongoing 177 blocks Quality check GE 18 pz/34 cp (19 %) miRNA 11 paz/23 cp (13%) GE 118 paz 85 P (25 anche M) 33 M Tot 143 cp miRNA 125 paz 94 P (29 anche M ) 31 M Tot 154 cp

I TMA MITO 7 Sono stati allestiti 3 TMA Sono stati inseriti nei TMA due carotine da ogni blocchetto per assorbire parzialmente i problemi derivanti dalla eventuale eterogeneità “orizzontale”, tra due zone vicine dello stesso blocchetto Abbiamo randomizzato la distribuzione dei blocchetti nei TMA, garantendo che i campioni di uno stesso paziente cadano nello stesso TMA Abbiamo inserito come controlli in ogni TMA due carotine di tre tube diverse e 4 linee cellulari Tagliamo i TMA (e le sezioni intere) in una unica sessione di lavoro e vi inviamo due sezioni di ogni TMA (e due sezioni intere) (siglate A=superficiale e B= profonda) corrispondenti a sezioni distanti tra di loro un numero fisso di sezioni in modo da valutare eventuale eterogeneità “verticale”, tra due zone a diversa profondità della stessa carotina

SONO STATE EFFETTUATE LE IMMUNOISTOCHIMICHE PER pACC e DNAPK E’ IN CORSO L’ ANALISI STATISTICA Valideremo i dati ottenuti nello studio MITO2??????

Stato dell’arte dei campioni MITO 16 A

357 patients (89%) with tumor sample available 16 patients: with sample not available 384 patients enrolled in institutions contributing to biomarker study (606 blocks) 10 patients: tumor sample collected after start of chemotherapy (6 IDS, 1 RIST, 3 post chem) 170 pz ongoing revision by Canzonieri 374 patients enrolled in institutions contributing to biomarker study (17)+67 patients: inadequate block (morphology) 17 patients: inadequate block revision N paz esclusi 16+10+17+67=110 N paz esclusi 16+10+17=43 357 patients (89%) with tumor sample available for IHC analysis 290 patients (72,5%) with tumor sample available for nucleic acid extraction 248 pz P (57 anche M) 105 pz solo M 4 pz sede da definire TOTALE BLOCCHETTI 414 TEORICAMENTE… 220 pz P (42 anche M) 66 pz solo M 4 pz sede da definire TOTALE BLOCCHETTI 332

Campioni MITO 16A: Campioni non disponibili (16) Centro Pt ID Motivo 320 281 Deceduta 603 332 ERRORE DIAGNOSI 145 170 In attesa 177 339 377 1 315 In attesa da altro ospedale (AORN Monaldi) 71 Restituiti per altri studi 117 43 165 367 24 RITIRO CONSENSO 119 355 388 123 Solo Vetrini 219 298 47 329

Campioni MITO 16A: Campione non basale (alla diagnosi) (10) ID CENTRO ID PAZ Motivo 1 305 IDS 320 50 103 195 381 368 161 366 112 post chemio 153 154 160 212 Ristadiazione

MITO 16A: Campioni scartati come risultato della revisione 17 pz per IHC e per estrazione di acidi nucleici CENTRO ID PAZIENTE ID 1 3 6 331 145 75 92 135 279 366 240 250 270 337 320 306 302 367 187 379 380 97 603 69 89 610 129 12 pazienti: Materiale insufficiente per creazione TMA o sezione intera 5 pazienti: risultato revisione non coerente con la diagnosi di carcinoma ovarico

MITO 16A: Campioni scartati per l’estrazione degli acidi nucleici come risultato della revisione (67 pazienti) LA SCELTA DEL BLOCCHETTO E’ FONDAMENTALE CENTRO ID PAZIENTE ID 1 2 33 73 6 151 43 47 214 145 66 72 88 141 196 253 265 267 271 276 280 307 317 324 364 172 244 290 180 323 222 210 231 272 60 CENTRO ID PAZIENTE ID 320 16 17 25 35 37 46 59 171 179 216 237 264 344 236 371 355 233 270 390 360 268 296 367 14 19 31 34 43 322 359 CENTRO ID PAZIENTE ID 368 98 118 205 217 245 291 352 377 345 346 380 336 396 222 228 588 247 333 Il campione deve avere almeno una area di cm 0,5x 0,5 con >70%cellule tumorali e <del 20% di necrosi!!!!!!!!!!!!!!!

Pazienti non utili per estrazioni acidi nucleici MITO 16 A Pazienti non utili per estrazioni acidi nucleici Pazienti non utili per IHC CENTRO ID PAZIENTI (n=110) 1 7 6 2 43 47 145 24 160 172 180 219 222 240 270 272 320 21 344 355 4 360 366 3 367 10 368 8 377 380 396 588 603 610 CENTRO ID PAZIENTI (n=43) 1 4 6 43 47 145 9 160 219 240 270 320 355 366 3 367 368 380 603 610

Cosa abbiamo fatto e cosa dobbiamo fare con i blocchetti ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI: Caratteristiche necessarie del campione: >70% di tumore e < del 20% di necrosi DNA: quantità necessaria 1,5 microgrammi, estrazioni da 2 carotine completate. controllo di qualità (Mario Negri): completato! RNA: quantità necessaria 3 microgrammi, estrazioni da sezione e/o macrodissezione e/o da carotine: completata. controllo di qualità (INT-Mi) completato! IHC: 58 proteine TMA: 2 carotine da ogni blocchetto ma 50 blocchetti di 43 pazienti presentano una morfologia tale che non è possibile carotare, quindi le IHC su TMA prevedono X vetrini TMA + 50 vetrini sezione intera 39 proteine su TMA 19 proteine su Sezione intera

ESTRAZIONI E CONTROLLO DI QUALITA’ DEGLI ACIDI NUCLEICI 290 patients (72,5%) with tumor sample available for nucleic acid extraction 220 paz P (42 anche M) 66 paz solo M 4 paz sede da definire TOTALE BLOCCHETTI 332 TEORICAMENTE… DNA estratto da 359 cp, (28 cp con contenuto tum <70%) Quality check 16 cp NGS 296 paz 224 P (41 m) 72 M Tot 337 cp Insuf 6 cp RNA 290 PAZ 219 P (41M) 67 SOLO M 4 pz sede da def 331 BLOCC Quality check miRNA 11paz/13 cp (4%) GE 18pz/21 cp (6%) GE 272 paz 209 P (38 anche M) 63 M Tot: 310 cp miRNA 279 paz 215 P (39 anche M) 64 M Tot: 318 cp

Stato dell’arte dei campioni MITO 16 B

MITO 16B 405 pazienti 118 pz dalla fase 4 : 4 paz blocchetto non ricevuto 4 pz esclusi perché post chemio 1 pz esclusa dalla revisione 25 pz non utili per estraz acidi nucleici per inadeguatezza del blocchetto Centralizzazione dei blocchetti di 129 pz. NUOVI: revisione ongoing IN CORSO LA RACCOLTA DEI BLOCCHETTI di 158 pazienti