Mutazioni e risposta al danno del DNA: meccanismi di riparazione del DNA Dr.ssa Daniela Barilà

Mutazione: processo che dà origine a sequenza DNA alterata Mutazione: sequenza alterata di DNA Mutazione: cambiamento del DNA che non viene individuato e/o corretto dai sistemi di riparazione del DNA Le mutazioni sono inevitabili: nessun processo cellulare è efficiente al 100%, però i meccanismi di riparazione servono a contenerle

Tipi di danno del DNA Cause di danno del DNA Risposta al danno del DNA: diversi tipi di danno, diverse risposte Difetti nella risposta al danno del DNA ed instabilità genomica Patologie genomiche associate ad instabilità genomica: alcuni esempi Ruolo della risposta al danno del DNA nello sviluppo di di terapie tumorali

Quattro classi di danno chimico del DNA 1) Rottura del filamento del DNA 2) Delezione di una base 3) Modificazione di una base 4) Cross-linking di basi

1) Rottura del filamento del DNA

2) Delezione di una base Idrolisi e taglio legame N-glicosidico: frequente in ambiente cellulare acquoso; produce un sito abasico spesso depurinazione

3) Modificazione di una base Oxoguanina (si appaia con adenina) Timina Glicole: non è mutageno ma blocca la DNA pol Addotto al DNA: formazione di un legame covalente qui di un idrocarburo aromatico con N7 guanina

4) Cross-linking di basi Formazione di nuovi legami covalenti tra basi dello stesso filamento (intrastrand cross-link): dimeri di pirimidina ciclobutano. E’ la forma di danno più diffusa prodotta da UV

4) Cross-linking di basi Formazione di nuovi legami covalenti tra basi su filamenti complementari (interstrand cross-link): legame covalente degli atomi di azoto N7 di due guanine su filamenti opposti (viene indotto dall’agente chemioterapico cisplatino)

Risposta al danno del DNA: diversi tipi di danno Danno al DNA di origine endogena: processi metabolici: danno chimico replicazione del DNA riarrangiamenti DNA nel sistema immunitario (VDJ recombination, class switch) Danno al DNA di origine esogena: radiazioni ionizzanti (IR): rotture radiazioni ultravioletto (UV): crosslinking e rotture diversi agenti chimici: alcune molecole producono ROS, altre tipo idrocarburi si legano in modo covalente al DNA formando addotti che causano distorsioni del filamento e rotture

Danno chimico endogeno al DNA Danno idrolitico: Depurinazione: perdita di una base purina (A o G) Depirimidinazione: perdita di una base pirimidina (C o T) c) Deamminazione: alcune basi vengono private dei gruppi amminici e viene lasciato un gruppo carbonilico C=O Ad esempio le citosine sono spesso deamminate a uracile e le metilcitosine a timina Ogni giorno ciascuna cellula nucleata perde circa 5000 purine e circa 300 pirimidine. Circa 100-500 C vengono sostituite con U.

Le mutazioni da C a T sono frequenti nel genoma umano

Danno ossidativo: Il normale metabolismo della cellula genera ROS (specie reattive dell’ossigeno) ROS: superossidi anionici (O2-), perossido di idrogeno (H2O2) e radicali ossidrili (OH.) Aggrediscono i legami covalenti negli zuccheri determinando la rottura dei filamenti del DNA. Aggrediscono anche le basi azotate specialmente le purine producendo derivati tossici (oxoguanina, mutagena perché si appaia con adenina)

Metilazione anomala del DNA: Oltre alla normale metilazione di C operata da Metiltransferasi, le cellule usano la SAM, S-adenosilmetionina, come donatore di gruppi metilici, e questa può metilare C ma anche A, dando origine a 3-metiladenina, una base citotossica che altera la struttura del DNA e le interazioni DNA-proteine (circa 300-600 A ogni giorno sono convertite in 3-me-A)

Errori nella replicazione del DNA Ad ogni replicazione per ogni cellula 6x109 nucleotidi devono essere inseriti in modo corretto per formare nuove molecole di DNA Errore polimerasi: mismatch (malappiamento) Attività esonucleasica (3’ 5’ “proofreading”) della DNA pol stessa. Se non funziona, mismatch repair

2) Errore polimerasi: slittamento nella replicazione 2) Errore polimerasi: slittamento nella replicazione. Avviene nelle regioni con sequenze ripetute, errore di allineamento. Correzione mediante mismatch repair

Risposta al danno del DNA: diversi tipi di danno Danno al DNA di origine endogena: processi metabolici :danno chimico replicazione del DNA riarrangiamenti DNA nel sistema immunitario (VDJ recombination, class switch) Danno al DNA di origine esogena: radiazioni ionizzanti (IR): rotture radiazioni ultravioletto (UV): crosslinking e rotture diversi agenti chimici: alcune molecole producono ROS, altre tipo idrocarburi si legano in modo covalente al DNA formando addotti che causano distorfsioni del filamento e rotture

La risposta al danno del DNA: previene la replicazione del DNA in presenza di un danno del DNA e la conseguente instabilità genomica Riparazione del DNA Apoptosi o Senescenza Danno al DNA Arresto del ciclo cellulare Sopravvivenza 1) Attivazione dei checkpoint cellulari per arrestare il ciclo cellulare 2) Attivazione dei meccanismi di riparazione del DNA 3) Riparazione del danno e ripresa del ciclo cellulare… oppure…il danno non è riparabile e si attiva la risposta apoptotica o la cellula entra in senescenza

From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev

Diversi tipi di danno al DNA e diversi meccanismi di riparazione From R. Hakem, 2008, EMBO J

Direct reversal: a differenza delle altre risposte non richiede l’attivazione di complessi multiproteici. Un esempio: O6-alkylguanina. L’alchilazione impedisce l’appaiamento con la citosina. Viene rimossa grazie all’azione di un singolo enzima, Ada in E. coli corrispondente a O6-methyltransferase, MGMT in cellule di mammifero. MMR pathway: Mismatch Rapair, presente in eucarioti e procarioti viene utilizzata per la riparazione di mismatches, ossia piccole inserzioni o delezioni. NER pathway: Nucleotide Excision Repair, presente in eucarioti e procarioti viene utilizzata per la riparazione di diverse lesioni tra cui lesioni causate da UV, mutageni chimici e chemioterapici che inducano la formazione di dimeri di pirimidina e addotti sproporzionati. 3 proteine (UvrA, UvrB, UvrC) in procarioti, più di 30 in mammifero. Rimozione e nuova saldatura sequenza nucleotidi nell’area danneggiata. BER pathway: Base Excision Repair, viene utilizzata in procarioti ed eucarioti per rimuovere basi danneggiate o correggere delezione singola base. DNA gliocosidasi rimuove la base e crea sito abasico, eliminato zucchero, inserito nuovo nucleotide.

Riparazione per escissione di basi, BER pathway: Base Excision Repair, viene utilizzata in procarioti ed eucarioti per rimuovere basi danneggiate o correggere delezione singola base. DNA gliocosidasi rimuove la base e crea sito abasico, eliminato zucchero, inserito nuovo nucleotide.

Riparazione per Escissione di nucleotidi NER pathway: Nucleotide Excision Repair, presente in eucarioti e procarioti viene utilizzata per la riparazione di diverse lesioni tra cui lesioni causate da UV, mutageni chimici e chemioterapici che inducono la formazione di dimeri di pirimidina e addotti sproporzionati. 3 proteine (UvrA, UvrB, UvrC) in procarioti, più di 30 in mammifero. Rimozione e nuova sintesi e saldatura sequenza nucleotidi nell’area danneggiata.

MMR pathway: Mismatch Rapair, presente in eucarioti e procarioti viene utilizzata per la riparazione di mismatches, ossia piccole inserzioni o delezioni. Si base su tre complessi enzimatici.

MMR pathway MutS “analizza” sequenza, MutL “attività endonucleasica” identifica segmento neosintetizzato, da correggere, che viene riconosciuto per la presenza di un nick PCNA e RCF stimolano endonucleasi PMS2, secondo nick EX01, esonucleasi rimuove singolo filamento tra i due nick Rottura Singolo filamento, altro filamento stabilizzato da RPA e usato come stampo da pol delta e ligasi I.

Riparazione rottura a singolo filamento (SSBs)

Danno al DNA su entrambi i filamenti: Double Strand Breaks (DSBs) Sono rare ma pericolose Avvengono fisiologicamente ad esempio nella ricombinazione V(D)J, uno speciale processo di riarrangiamento genico che dà origine ai geni codificanti i recettori per l'antigene nei linfociti B e linfociti T Sono indotte da ROS e da IR 2 principali meccanismi di riparazione: HR e NHEJ

Danno al DNA su entrambi i filamenti: Double Strand Breaks (DSBs) HR pathway: Homologous Recombination, viene utilizzata in procarioti ed eucarioti per risolvere rotture a doppio filamento (DSB). Viene utilizzata in circa il 90% dei casi di DSBs nei batteri ed in lievito, e solo nel 10% dei casi di DSBs in cellule di mammifero, in cui si preferisce l’attivazione della NHEJ. Richiede l’attivazione di una serie di complessi proteici e di una cascata di eventi di trasduzione del segnale. E’ molto accurata. NHEJ: Non Homologous End Joining, viene utilizzata in procarioti ed eucarioti per risolvere rotture a doppio filamento (DSB). Viene utilizzata solo in circa il 10% dei casi di DSBs nei batteri ed in lievito, e nel 90% dei casi di DSBs in cellule di mammifero. Richiede l’attivazione di una serie di complessi proteici e di una cascata di eventi di trasduzione del segnale. Non e’ molto accurata bensì error prone.

HR pathway

Sintesi translesione, mancato rilevamento del danno e tolleranza al danno del DNA Danno non rilevato: Mutazioni da C a T Sintesi translesione: per superare stallo forca replicativa. DNA pol specializzate riprendono la sintesi “saltando” il sito di danno: sono poco fedeli, forche replicative preservate ma il meccanismo introduce mutazioni. Filamento figlio fa poi da stampo per riparazione lesione via NER

From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev

Double Strand Breaks (DSBs): NHEJ or HR and cell cycle From S. Takeda et al., 2007, Mol Cell

La risposta cellulare attivata da DSBs è molto ben caratterizzata a livello molecolare Una cascata di eventi coordinata da: Sensori del danno Trasduttori 3) Effettori Tale risposta deve essere rapida e reversibile: modifiche post-traduzionali quali fosforilazioni ed ubiquitinazioni svolgono un ruolo centrale nella trasduzione del segnale di risposta. From Y. Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev

From Su, T.T, 2006, Annu Rev Genet

La risposta cellulare attivata da DSBs è molto ben caratterizzata a livello molecolare In seguito al DSBs il complesso MRN (MRE11/RAD50/NBS1) viene reclutato ai siti di rottura del DNA dove media a sua volta il reclutamento e l’attivazione della Ser/Thr chinasi ATM. Inoltre altre due Ser/Thr chinasi, ATR e DNA-PK sono attivate e partecipano attivamente alla risposta DSBs. Il complesso MRN promuove anche, grazie all’attività esonucleasica di MRE11, la resezione che porta alla formazione di DNA a singolo filamento, il quale a sua volta promuove l’attivazione di ATR. In pochi minuti dalla formazione di DSBs ATM, ATR e DNA-PK si attivano e fosforilano a loro volta altri trasduttori ed effettori necessari sia ad attivare la riparazione del DNA che ad attivare i checkpoints cellulari

Il complesso MRN (MRE11/RAD50/NBS1) MRE11: è una proteina che lega il DNA e possiede attività esonucleasica 3’-5’ oltre ad attività endonucleasica. Promuove quindi la resezione e la formazione di ssDNA necessaria per la ricombinazione omologa. Promuove inoltre l’attivazione di ATR. RAD50: è un membro della famiglia SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) e forma omodimeri che si associano con due molecole di MRE11 per formare complessi tetramerici MRE11-RAD50 che possono inserirsi tra le estremità libere del DNA oppure tra i cromatidi fratelli promuoveno la ricombinazione omologa. NBS1: presenta un dominio di legame con ATM ed è quindi necessaria per Il reclutamento di ATM ai siti di rottura del DNA e per la sua attivazione.

Il complesso MRN

Le PI3-like Ser/Thr chinasi svolgono un ruolo centrale come trasduttori della risposta di danno al DNA ATM ATR ATX/SMG1 DNA-PK mTOR/FRAP TRRAP 1 3056 2644 3031 4128 2549 3830 FAT FATC PI3-K Tali proteine sono altamente conservate nell’evoluzione.

Ruolo centrale nella risposta DSBs. ATM ATR ATX/SMG1 DNA-PK mTOR/FRAP TRRAP 1 3056 2644 3031 4128 2549 3830 FAT FATC PI3-K Ruolo centrale nella risposta DSBs. L’attività chinasica è finemente regolata da un complesso di interazioni intra ed intermolecolare. Induzione dell’attività chinasica in risposta a DSBs ed attivazione di una cascata di fosforilazioni con conseguente amplificazione del segnale.

ATM è presente nella cellula come dimero inattivo. In seguito a danno del DNA ATM subisce un cambio conformazionale che ne induce l’attività chinasica e l’autofosforilazione in Ser1981 che determina il rilascio dal dimero di due molecole di monomero autofosforilate ed attive in grado di mediare la fosforilazione di substrati sia in prossimità dei DSBs che piu’ genericamente nel nucleo. From Bakkenist and Kastan, 2003, Nature

Ruolo di ATM nel riparazione del DNA ATM colocalizza ed induce la fosforilazione dell’istone H2AX in Ser139 ai siti di rottura del DNA. Tale evento promuove la formazione degli IRIF (Ionizing Radiation Induced Foci). Agli IRIF vengono reclutati e fosforilati diversi fattori tra cui: MDC1, 53BP1, RNF8, BRCA1, CHK2 e p53. Inoltre RAD51 e RAD52 direttamente coivolte nel riparazione vengono fosforilate.

Formazione dei foci in seguito ad IR

Ruolo di ATM nel controllo del ciclo cellulare From Shiloh, 2003, Nat Cancer Rev

From Rotman and Shiloh, 1999, Oncogene

Patologie genomiche associate a mutazioni di geni coinvolti nella riparazione del DNA Sono patologie genetiche autosomiche recessive associate a mutazioni a carico di geni codificanti per proteine importanti nella risposta al danno del DNA. Tali patologie sono generalmente associate ad instabilità cromosomica, aberrazioni del sistema nervoso ed immunitario ed ipersensibilità delle cellule agli agenti che inducono il tipo di danno la cui risposta è non funzionante. Inoltre spesso tali patologie sono anche associate ad una maggiore frequenza di sviluppo tumorale, spesso, ma non solo, di tumori del sistema immunitario.

3 sindromi associate a difetti nella risposta NER Xeroderma Pigmentosum (XP): e’ una sindrome generata da mutazioni in uno o più geni XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF, XPG. E’ caratterizza da ipersensibilità a UV e da altissima incidenza di tumori della pelle. Cockayne syndrome: è una sindrome associata a mutazioni in CSA o CSB, proteine richieste per NER. E’ una patologia caratterizzata da malformazioni e ritardo mentale grave. Si osserva in alcuni casi un’alta incidenza di tumori della pelle come per XP. Tricothiodystrophy (TTD): è una sindrome associata a mutazioni nelle proteine XPB e/o XPD. Ritardo mentale e fotosensibilità. Non si osservano correlazioni con lo sviluppo di tumori della pelle.

Bloom’s syndrome (BS): è una sindrome rara causata da mutazioni della proteina BML una DNA elicasi importante nella risposta HR a DSBs. Maggiore possibilità di sviluppare vari tumori. Werner’s syndrome (WS): WS è un’altra RECQ elicasi. Le mutazioni di WS sono associate ad una patologia in cui si riscontra maggiore propensione allo sviluppo di tumori Rothmund-Thompson syndrome (RTS): è generata da mutazioni di un’altra RECQ elicasi. Anche questa patologia si associa ad un aumentato rischio di sviluppare tumori della pelle ed osteosarcomi. Fanconi’s anemia (FA): E’ una patologia molto eterogenea caratterizzata da anemia aplastica. Ci sono almeno 8 diversi “FA genes”.

Ataxia Telangiectasia (A-T): rara patologia genetica, causata da mutazioni del gene ATM. E’ caratterizzata da neurodegenerazione, telangiectasia, immunodeficienza e da un’alta incidenza di linfomi e leucemie. Nijmegen Breakage Syndrome (NBS): mutazioni a carico della proteina NBS1 che impediscono il corretto funzionamento. Patologia caratterizzata da neurodegenerazione e da alta incidenza di B/T linfomi. Ataxia Telangiectasia Like Disease (ATLD): Mutazioni a carico di MRE11. Alta incidenza di tumori.

Diverse sindromi da instabilità genomica sono correlate tra loro in quanto le proteine codificate dai geni mutati sono funzionalmente correlate e partecipano alle stesse vie di trasduzione del segnale A-T and NBS: ATM viene attivato e a sua volta fosforila NBS1 A-T and Fanconi Anemia: ATM fosforila FANCD2 A-T and Bloom’s Syndrome: ATM fosforila BLM

Terapie anti-tumorali e risposta al danno del DNA

Ruolo della risposta al danno del DNA nello sviluppo di di terapie anti-tumorali Radio e chemioterapia: cercare di colpire “selettivamente” le cellule tumorali e non quelle sane. Pertanto tutti gli approcci di sviluppo di nuove terapie si basano sulla comprensione delle differenze tra cellule tumorali e non Una differenza fondamentale è che le cellule tumorali proliferano maggiormente. Pertanto molti approcci sono mirati a colpire il ciclo cellulare. Un approccio molto utilizzato si basa sull’uso di sostanze che inducono danno del DNA. Infatti le cellule tumorali in presenza di danno al DNA non arrestano il ciclo. Ciò rende tali sostanze particolarmente tossiche per le cellule che continuando a replicarsi e hanno così maggiori probabilità di andare incontro a morte.

From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev

Ruolo della risposta al danno del DNA nello sviluppo di di terapie anti-tumorali Chemioterapici classici: induttori di danno del DNA Nuovi Chemioterapici : Agenti che impediscono la riparazione del DNA Favoriscono accumulo danno DNA e mutazioni Possono essere usati per letalità sintetica

DNA Repair and PARP-1 PARP-1: un enzima chiave nella riparazione di danno al DNA. In particolare è coinvolto nel riparazione di rotture a singolo filamento (SSB). Catalizza la conversione da NAD+ a Nicotinamide e poly-ADP ribosio. Si producono catene ramificate di ADP-ribosio che modificano PARP stesso ed alcuni suoi target e favoriscono il reclutamento di proteine al DNA. Nella risposta a SSB PARP-1 facilita il reclutamento e l’attivazione di proteine coinvolte nella riparazione.

DNA Repair and PARP-1

Sviluppo approcci terapeutici mirati ad inibire PARP-1 From Bolderson et al., 2009, Clin Cancer Res

Instabilità genomica e selezione della terapia anti-tumorale I diversi tumori umani vengono principlmente raggruppati in base al fenotipo clinico indipendentemente dall’eterogeneità dei meccanismi molecolari che ne possono essere alla base. Pazienti con le stesse caratteristiche clinico-patologiche rispondono molto diversamente allo stesso trattamento ed hanno prognosi molto differenti. Spesso quesa osservazione correla con una molteplicità di alterazioni dei meccanismi molecolari che controllano la risposta al danno del DNA. In linea di principio i tumori potrebbero quindi essere suddivisi in base agli specifici difetti molecolari nelle risposte di danno al DNA. Ciò consentirebbe di creare una tassonomia alternativa dei diversi tipi di tumori forse maggiormente informativa dal punto di vista terapeutico.

Instabilità genomica e selezione della terapia anti-tumorale Una sfida centrale dello sviluppo delle terapie anti-tumorali è riuscire a colpire efficacemente e selettivamente le cellule tumorali e ridurre al contrario la tossicità per le cellule normali. Recentemente per rispondere a questa esigenza è stato introdotto il concetto di SYNTHETIC LETHALITY (LETALITA’ SINTETICA).

Synthetic lethality (Letalità sintetica) Due geni o due proteine vengono definiti LETALI SINTETICI quando la deficienza nell’espressione di uno dei due non compromette la vitalità, mentre la contemporanea alterazione in entrambi è incompatibile con la sopravvivenza cellulare. La Letalità sintetica è stata proposta come meccanismo per sviluppare terapie specifiche mirate ad identificare e colpire quei geni la cui perdita di funzione potesse essere selettivamente letale in combinazione con la mutazione in geni di suscettibilità tumorale presente nella cellula tumorale.

Synthetic lethality (Letalità sintetica) From Martin SA et al. J Pathol 2009: DOI:10.2002/path.2631 Copyright © 2009 Pathological Society of Great Britain and Ireland. Published by John Wiley & Sons, Ltd.

Synthetic lethality (Letalità sintetica) Combinare: Agente che produce danno del DNA + Agente che inibisce riparazione del DNA Oppure Bloccare una via di riparazione in un tumore dove un’altra via di riparazione è già fortemente compromessa (HR e NHEJ)

Synthetic lethality (Letalita’ sintetica) Combinare: Agente che produce danno del DNA in un tumore deficiente nel sistema di riparazione preposto alla riparazione di quel danno. Combinare: Methotrexate, induce lesioni sul DNA riparate attraverso MMR. In un contesto in cui MMR è mutato si genera accumulo di 8-oxoG che induce apoptosi.

Synthetic lethality (Letalità sintetica) From Martin SA et al. J Pathol 2009: DOI:10.2002/path.2631 Copyright © 2009 Pathological Society of Great Britain and Ireland. Published by John Wiley & Sons, Ltd.

BRCA1 si rilocalizza ai punti di rottura del DNA (foci positivi per H2AX)

Inibizione di PARP-1 e terapia anti-tumorale: un esempio di sviluppo di terapia basato di concetto di letalità sintetica L’inibizione di PARP-1 colpisce maggiormente cellule caratterizzate da difetti molecolari nella risposta HR di riparazione (per esempio BRCA1 e BRCA2) mentre ha tossicità molto ridotta per le cellule normali. Inibizione di PARP-1 e mutazioni geni BRCA1 e BRCA2 in tumori ovarici e della mammella.

From Helleday et al., 2008, Nat Cancer Rev