capacità di caricamento Cromatografia liquida ad alta pressione preparativa Parametro critico: capacità di caricamento Nelle applicazioni industriali: quantità di componente separato per unità di tempo Questo fattore dipende da: Dimensioni della colonna Velocità del flusso Viene spesso incrementato a spese della purezza. Sulla base della quantità di materiale si distingue Scala analitica  mg Scala semipreparativa  centinaia di mg Scala preparativa  da g a kg

Scelta delle condizioni per la separazione su scala preparativa I. Scelta del metodo LC (fase diretta o inversa) (mediante analisi preliminare su TLC) II. Separazione di piccole quantità di campione su colonna analitica III. Ottimizzazione della separazione analitica K’ più bassi possibile per diminuire tempi di analisi R più alta possibile per tener conto della perdita in efficienza nel passare al sistema preparativo IV. Estrapolazione alle condizioni preparative V. Realizzazione della separazione VI. Recupero del materiale purificato VII. Controllo della purezza delle frazioni recuperate (TLC o HPLC analitica)

Colonna Fase stazionaria Fase mobile Il sistema HPLC Relazione tra diametro della colonna, difficoltà della separazione e quantità massima di campione caricabile Fase stazionaria Silice per fase diretta: particelle regolari o irregolari 10-40 mm Silice modificata per fase inversa: C-18 particelle regolari fino a 10 mm Materiali polimerici : stirene-divinilbenzene, pH 1-13 Fase mobile Dipende dal tipo di fase stazionaria . E’ particolarmente importante la purezza. Il sistema HPLC Pompe: sono richiesti flussi da 10 a 100 mL/min La precisione del flusso è meno importante che in LC analitica. Rivelatori: devono sopportare flussi molto elevati. Parte dell’eluato può essere deviato fuori. Non è richiesta elevata sensibilità. I più comuni:UV ed RI. Introduzione del campione: A flusso interrotto via siringa; Attraverso valvole; Attraverso la pompa principale o una pompa ausiliaria.

Sovracaricamento di volume Principali problemi Sovracaricamento di volume Si verifica con campioni di bassa solubilità Come si riconosce: Costanza del volume di ritenzione del fronte dei picchi Picchi di forma rettangolare Distorsione del profilo del cromatogramma II

2. Sovracaricamento di massa Si verifica con soluzioni di campione troppo concentrate Si osserva: I. Effetti di dispersione: ll campione viene distribuito lungo la colonna dalla fase mobile finchè non viene a contatto con una quantità di fase stazionaria sufficiente a permettere l’equilibrazione con la fase stazionaria allargamento delle bande. II. Disattivazione dell’adsorbente: Quantità elevate di campione occupano una porzione significativa della fase stazionaria aumentando la polarità effettiva della fase mobile rispetto alla fase stazionaria  diminuzione dei tempi di ritenzione anche dei componenti presenti in minori quantità. Grandi quantità di campione danno luogo ad isoterme di adsorbimento non lineari picchi codati. Come si riconosce: Variazione dei volumi di ritenzione del fronte dei picchi per tutti i componenti della miscela. Allargamento e codatura dei picchi per i componenti presenti in eccesso. 180 mg 8.1 mg 16.9 mg Miscela di benzene , naftalene ed antracene. La quantità di benzene è variata mentre quella di naftalene ed antracene è mantenuta costante.

Metodi di raccolta e separazione Taglio e reciclo Reciclo a b a b a puro b puro a puro b puro Separazione analitica  Separazione preparativa  Separazione dei componenti reciclati Taglio della parte centrale “cuore” Separazione analitica  Sovracaricamento  Reciclo a B A Separazione analitica Caricamento massimo per la risoluzione di a Sovracaricamento a Taglio del cuore Taglio della coda del picco Per la separazione di componenti minori

Dolcificanti in bevande dietetiche Applicazioni HPLC Sito: http://ansysinc.com/products/chrom/lc/lc_apps.html Dolcificanti in bevande dietetiche Concentrazione dei dolcificanti in tre bevande dietetiche tipo cola S=saccarina, A= aspartame C=caffeina, B = acido benzoico Chromatographic Conditions Column:MCH-5 N-Cap C-18, 150 x 4.6mm Thermostatted to 30°C Mobile Phase: 90% 0.01M KH2PO4 ,pH=2.5/10% Methanol to 60% Buffer/40%Methanol in 25 minutes Flow Rate: 1.3 ml/min Detection: 256 nm Sample Preparation:Samples of soft drinks were directly injected with no cleanup prior to injection.

Neurotrasmettitori amminoacidici in tessuti Analisi dopo derivatizzazione con o-ftalaldeide solfito Rivelazione ECD 1: serina 2: glicina 3: taurina 4: glutammato 5: arginina 6: alanina 7: reattivo OPA 8: GABA Conc per ciascun composto:1 mmol/L Miscela di standard Colonna: C-18 250x4.6 mm, 5 mm Flusso: 0.70 mL/min Fase mobile: Fosfato 100 mM, pH 4.5, EDTA 0.5 mM, MeOH 25% Rivelatore: ECD elettrodo di lavoro in vetro Potenziale elettrodo: 850 mV (contro Ag/AgCl) Tessuto da ippocampo di ratto 1: Glutammato 3.6 nmol/L; 2: GABA 1.7 nmol/L.

Catecolammine/ammine biogeniche DOPA: dihydroxyphenylalanine DHBA: dihydroxybenzylamine DOPAC: dihydroxyphenylacetic acid NE: norepinephrine DA: dopamine HIAA: hydroxyindoleacetic acid EP: epinephrine AVA: homovanillic acid 5HT: hydroxytryptamine 3MT: methoxytyrosine Standards (2 pmol; DHBA 5 pmol) Striato di ratto Corteccia di ratto Condizioni di analisi Campione: 10 mg/mL ciascuno standard; vol 20 mL; 2 mg campione tessuto Colonna: Zorbax S8 C8, 4.6x75 mm, 3.5 mm Fase mobile: sodio fosfato 0.14 M, EDTA 20 mM, ottansolfonato 0.75 mM, MeOH 9.5%, pH 3.5 Flusso: 1.5 mL/min Temperatura: 26°C Rivelatore: ECD, potenziale 750 mV contro Ag/AgCl

Idrocarburi policiclici aromatici (PAH) in acque   Idrocarburi policiclici aromatici (PAH) in acque Presenti nell’ambiente acque, suoli, aria. Derivano sia da processi di combustione naturale che da combustione industriale Sono difficili da dosare soprattutto quando presenti in acque. Si usano tecniche di pre-concentrazione con metodi di estrazione in fase solida. Nell’analisi HPLC si usano: Rivelatori UV Rivelatori a serie di diodi Rivelatori di fluorescenza Rivelazione UV 254 nm  

Rivelazione di fluorescenza Miscela standard di PAH Campione di acque Confronto dei limiti di rivelabilità con i tre metodi

Rivelazione con serie di diodi

Antibiotici amminoglicosidici : Tobramicina Analisi della tobramicina Derivatizzazione pre-colonna Si ottengono due derivati principali anche se per la presenza di più siti amminici primari si potrebbero prevedere numerosi prodotti. Condizioni di analisi Colonna: C-8; 4 mm x 15 cm Fase mobile: fosfato 0.02 M pH 6.5:Acetonitrile 52:48; 2 mL/min Rivelazione: fluorescenza Ex 340 nm Em 450 nm. Usando la fluorescenza il limite di rivelazione è 400 volte più alto di quello ottenuto con rivelazione UV.

Zuccheri del latte Rivelazione con indice di rifrazione a 50°C Colonna: silice-NH2 tenuta a 80°C Latte intero : contiene solo lattosio Latte a contenuto ridotto di lattosio: il lattosio è idrolizzato a dare galattosio e glucosio

Propranololo: separazione chirale Mediante questo tipo di derivatizzazione si raggiungono tre obiettivi: Separazione chirale Aumento della sensibilità della rivelazione Aumento della selettività della rivelazione Rivelazione UV Rivelazione fluorimetrica Aumenta la sensibilità Elimina le interferenze