Metabolismo dell’azoto   Tutti gli organismi sono capaci di convertire l’ammoniaca in composti organici azotati cioè sostanze contenenti legami C-N Sono molto meno gli organismi in grado di sintetizzare ammoniaca a partire da N inorganico, cioè l’azoto molecolare (N2), costituente principale dell’atmosfera terrestre, e lo ione nitrato (NO3 –), presente nel suolo ed essenziale per le piante Il primo processo di riduzione dell’N2 in NH4 + è detta FISSAZIONE BIOLOGICA DELL’AZOTO, ed è svolta da particolari microrganismi in simbiosi o meno con piante Il secondo processo di RIDUZIONE DEI NITRATI presenti nel suolo è ampiamente diffuso sia in piante che microrganismi

Nella biosfera c’è un costante equilibrio tra l’azoto totale inorganico e quello organico La conversione dell’azoto dalla forma organica, attraverso la fissazione biologica o la riduzione dei nitrati, è controbilanciata dal catabolismo e cioè dalla DENITRIFICAZIONE e dalla DECOMPOSIZIONE Il catabolismo produce ammoniaca e altri composti organici azotati che possono essere metabolizzati da diversi batteri: Nitrosomonas ossida l’ammoniaca a nitrito Nitrobacter ossida il nitrito a nitrato I batteri denitrificanti catabolizzano invece l’ammoniaca a N2

Gli animali eterotrofi utilizzano azoto già contenuto in molecole organiche vegetali. Essi poi utilizzano i "mattoni" per la costruzione delle proprie proteine Al contrario delle piante, gli animali effettuano l'escrezione di N sotto forma di urea ed acido urico. Da queste molecole può essere nuovamente liberata NH3 per attività della ureasi (batteri, terreno, piante) NH3 si forma anche in processi di putrefazione Nel terreno è presente NH3 sotto forma di NH4+ assorbita dai colloidi

Fissazione dell'azoto atmosferico Dando uno sguardo al ciclo dell'azoto è chiaro che l'azoto fissato in forma inorganica (nitrati ed ammoniaca) ed organica tende, attraverso vari processi, a ritrasformarsi in N2 Occorre pertanto un processo contrario che renda l'N2 atmosferico di nuovo disponibile per le piante (riduzione dell'N2 a NH4+). Questo avviene attraverso la FISSAZIONE BIOLOGICA DELL’AZOTO ATMOSFERICO Secondo una stima, la fissazione dell'N2 ammonta annualmente a 9x1010 Kg

La fissazione dell’N2 è prerogativa esclusiva di alcuni batteri ed alcune specie di alghe blu, liberi o in simbiosi con piante superiori I microrganismi fissatori si distinguono a seconda della pianta ospite: 1° gruppo: Leguminose Queste piante ospitano nei tubercoli radicali una forma degenerata del Rhizobium (come batteroide) Inizialmente si pensava che si trattasse di una malattia, in quanto no era nota la capacità di fissazione dell’azoto atmosferico Esiste una stretta associazione metabolica fra la pianta ospite ed il Batteroide. Né il Rhizobium né la pianta sono in grado da soli di fissare l'N2 Non si conoscono i fattori che attraverso la simbiosi consentono al Batteroide di fissare l'N2

2° gruppo: non Leguminose Anche in angiosperme e gimnosperme si trovano microrganismi in tubercoli radicali. L'endofita delle angiosperme non è ancora ben noto. Probabilmente si tratta di Actinomiceti. Presso alcune gimnosperme svolgono questo ruolo simbiotico alcune alghe blu Il contributo di organismi non simbionti al totale dell'N2 fissato è relativamente scarso Esistono tuttavia batteri N2-fissatori nell'intestino di mammiferi (uomo, maialino d'india). Essi sono stati molto utili per chiarire i meccanismi biochimici della fissazione (Clostridium pasteurianum, Azotobacter vinelandii, Klebsiella pneumoniae, Bacillus polymyxa, Rhodospirillum rubrum)

Meccanismo di fissazione dell'azoto Il punto focale della N2-fissazione è costituito dalla reazione catalizzata da un enzima: la NITROGENASI La fissazione dell'azoto attraverso estratti liberi da cellule procede solo in anaerobiosi L'enzima viene infatti disattivato irreversibilmente dalla presenza di O2 Questo e la mancanza di un isotopo radioattivo dell'azoto spiegano le difficoltà incontrate nel chiarire questo meccanismo

2 + 8e- + 8H+ + ATP -----> 2NH3 + H2 + ADP + Pi Secondo i primi studi effettuati la reazione di fissazione biologica era la seguente: N2 + 6e- + 6H+ -----> 2NH3 Studi ulteriori sottolinearono che per avvenire la fissazione era necessaria l’idrolisi di ATP e veniva liberato idrogeno gassoso Il meccanismo biologico di fissazione richiede inoltre 8 elettroni invece che 6, i due aggiuntivi sono necessari per la produzione dell’idrogeno gassoso: 2 + 8e- + 8H+ + ATP -----> 2NH3 + H2 + ADP + Pi

La fissazione è quindi operata dall’enzima nitrogenasi che si compone di due parti: (DI) NITROGENASI RIDUTTASI (omodimero di 64kDa) (DI)NITROGENASI (eterotetramero di 240 kDa) Questo complesso enzimatico è localizzato nel citosol del batteroide La nitrogenasi lega l’N2 e lo trattiene sin quando non viene ridotto, mentre la nitrogenasi riduttasi fornisce elettroni per la riduzione Dopo la riduzione della nitrogenasi riduttasi con 1 elettrone, 2 moli di ATP si legano ad essa e determinano cambiamenti conformazionali per cui il potenziale redox dei centri Fe-S cambia da -0.25 a -0.4 V

N2 + 4NADH + 4H+ + 16 ATP 2NH3 + H2 + 4NAD+ + 16 ADP + 16P La NITROGENASI è un tetramero e contiene 2 siti catalitici indipendenti (2 centri Fe-S) ed anche un cofattore FeMoCo La nitrogenasi opera la riduzione dell’N2 utilizzando gli elettroni che gli sono stati ceduti dalla Nitrogenasi Riduttasi 8H+ + 8e- + N2 2NH3 + H2 Considerando la reazione precedente il bilancio della fissazione dell’N2 è dato da: N2 + 4NADH + 4H+ + 16 ATP 2NH3 + H2 + 4NAD+ + 16 ADP + 16P Ancora oggi non è chiaro perché viene evoluto H2 durante il processo

La NITROGENASI RIDUTTASI è un omodimero che contiene un singolo centro 4Fe-4S e spesso è chiamata Fe-proteina Una caratteristica peculiare della nitrogenasi riduttasi è quella che nella forma ridotta l’enzima può legare 2 molecole di MgATP che determina cambiamenti conformazionali della struttura. In questa nuova forma, la nitrogenasi riduttasi si lega più strettamente alla nitrogenasi La nitrogenasi riduttasi ossidata accetta un elettrone che proviene dalla ferredossina, lega 2 moli di MgATP e trasferisce l’elettrone alla nitrogenasi L’ATP è quindi idrolizzato a produrre 2 moli di MgADP e 2 Pi in una reazione che vede coinvolte entrambi i complessi della nitrogenasi

La NITROGENASI RIDUTTASI trasferisce elettroni sequenzialmente alla nitrogenasi dove essi si accumulano prima nei centri F-S e quindi sono trasferiti al complesso FeMoCo, che a questo punto lega l’N2 Con la riduzione della nitrogenasi, il complesso acquisisce sino a 4 idrogeni prima di legare l’N2 e prima che la riduzione inizi Quando l’N2 si lega, si ha il rilascio dell’idrogeno gassoso come prodotto di scarto, ma la nitrogenasi può ancora rilasciare improduttivamente idrogeno senza legare l’N2

La nitrogenasi è sensibile all’ossigeno La ragione principale che consente la fissazione dell’azoto nei noduli delle radici delle piante infettate da Rhizobium è che questi noduli contengono elevate quantità di LEGHEMOGLOBINA che mantiene l’ambiente anaerobico legando tutto l’ossigeno che trova accesso ai noduli La leghemoglobina è localizzata nel citosol delle cellule ospite ed è normalmente presente ad elevate concentrazioni

In presenza di alcune specie di rizobio, le leguminose formano una struttura caratteristica che è il NODULO RADICALE in cui avviene la fissazione dell’azoto Nell’ambito del nodulo avvengono sia la fissazione dell’azoto che la sintesi di ATP da parte del batterio La pianta nei noduli genera acidi organici che nutrono il batterio e forniscono scheletri carboniosi utilizzati per il trasporto dei composti azotati necessari per trasferire l’azoto fissato al resto della pianta

La cellula ospite scambia con il batteroide essenzialmente MALATO formato dalla sintesi del saccarosio La saccarosio sintasi scinde il saccarosio in glucosio che tramite la glicolisi viene ossidato sino a PEP che è carbossilato ad ossalacetato (OAA) e quindi ridotto a malato L’NH3 formato dalla fissazione nelle cellule ospiti viene inizialmente convertito in GLUTAMMINA e trasportato tramite lo xilema nei vari organi della pianta

Saccarosio Malato Batteroide Fissazione N2 N2 NH4+ Glutammina

Il nodulo radicale è quindi formato dalla pianta ospite L’infezione avviene normalmente attraverso i peli radicali i quali rispondono a specifici segnali batterici alterando la loro crescita per intrappolare il potenziale simbionte Anche la struttura attraverso cui avviene l’infezione (FILAMENTO INFETTIVO) può essere formata dalla pianta e si compone di materiale della parete cellulare Il filamento infettivo riempito di batteri in attiva crescita penetra negli starti radicali per incontrare le cellule della pianta in divisione

Dopo che il filamento infettivo è penetrato in uno o più strati di cellule ospiti, i batteri vengono rilasciati in vacuoli legati alle membrane ed entrano nella cellula ospite Questi vacuoli sono denominati SIMBIOSOMI e possono contenere da uno a più batteri

In simbiosi i batteri differenziano i BATTEROIDI che sono talvolta morfologicamente distinguibili dai batteri liberi

I noduli sono strutture relativamente semplici che contengono da decine a poche centinaia di proteine nodulo-specifiche sintetizzate dalla piante e chiamate NODULINE Una caratteristica essenziale della simbiosi è il mutuo riconoscimento tra pianta ospite e simbionti batterici: composti rilasciati dalla pianta inducono l’espressione di geni batterici implicati nella simbiosi (geni nod) I segnali associati all’espressione di questi geni sono normalmente i FLAVONOIDI

RIDUZIONE ASSIMILATORIA DEI NITRATI   Le piante verdi, i batteri ed i funghi sono in grado di prelevare i nitrati dal terreno e ridurli a NH3 e trasferire quest'ultima nei composti azotati tipici della cellula Il nitrato viene assorbito dalla soluzione circolante del suolo attraverso le cellule epidermiche e corticali della radice Il trasporto di nitrato nelle radici procede con un simporto di 2 protoni. Un gradiente protonico trans-membrana, generato da un H+-ATPasi, permette il trasporto del nitrato contro gradiente e l’ATP richiesto deriva dalla respirazione mitocondriale Il nitrato deve quindi essere ridotto a nitrito dalla NITRATO RIDUTTASI e quindi ad ammonio attraverso l’azione dell’enzima NITRITO RIDUTTASI

RIDUZIONE DEL NITRATO: ENZIMA NITRATO RIDUTTASI Il primo step è la riduzione dei nitrati a nitriti Il potere riducente è rappresentato dal NADH o NADPH La NR è un metallo-enzima che possiede siti per il legame con il NAD(P)H e per il nitrato Sono presenti 3 cofattori, forniscono centri redox per il trasporto degli elettroni: FAD (-272 mV) un gruppo Fe-eme (-160 mV) un cofattore contenente molibdeno (MoCo) (-10 mV) NO3- + NAD(P)H + H+  NO2- + NAD(P)+ + H2O

RIDUZIONE DEL NITRITO IN AMMONIACA: enzima NITRITO RIDUTTASI NO2- + NAD(P)H + H+ (o Fdred)  NH4+ + NAD(P)+ (o Fdox) L’enzima responsabile è la NITRITO RIDUTTASI, che è localizzata nei plastidi e per il suo meccanismo occorre fare distinzione fra : a) tessuti non fotosintetizzanti, (radici) e funghi. Il donatore di elettroni in vivo è probabilmente NADPH attraverso ripetute cessioni di 2 elettroni all'NO2-. Il NADPH proviene probabilmente dal ciclo dei pentosi fosfati (ossidativo). Il NADPH riduce la ferredossina in una reazione catalizzata dalla Fd-NADP riduttasi b) tessuti fotosintetici. L'enzima è localizzato nei cloroplasti. L’elettrodonatore è la Ferredossina. L'enzima è inducibile da nitrito e nitrato

Equazione generale NO3 - + 8H+ + 8e-  NO3 + H2O + OH -   NO3 - + 8H+ + 8e-  NO3 + H2O + OH - Si consumano otto equivalenti di elettroni e otto equivalenti di idrogenioni nella riduzione di un grammoione di NO3- a NH3 La reazione risulta in una alcalinizzazione con la produzione di 1 equivalente di OH-. Ciò induce un accumulo di acidi organici, in particolare di acido malico nel citoplasma e nei vacuoli

Interazione tra assimilazione nitrato e metabolismo carbonio   Deviazione della sintesi dell’amido verso la produzione di aminoacidi ed acidi organici come il malato La PEPcase che catalizza la sintesi di OAA, il quale è quindi convertito in -chetoglutarato, è regolata da alte concentrazioni di nitrato L’ADP-glucosio pirofosforilasi è invece sottoregolata da alte concentrazioni di nitrato

La luce svolge un ruolo importante nella assimilazione dei nitrati Basse intensità luminose deprimono la riduzione dei nitrati favorendone l'accumulo nei vegetali, soprattutto in corrispondenza di abbondanti concimazioni nitriche Ciò può costituire un pericolo quando i vegetali siano destinati ad alimentazione del bestiame o all'alimentazione umana

Assimilazione dell’ammoniaca: BIOGENESI DELL’AZOTO ORGANICO   Indipendentemente dalla fonte di azoto, tutti gli organismi hanno in comune un numero limitato di vie metaboliche per l’utilizzo dell’azoto inorganico sotto forma di ammoniaca L’ammoniaca in concentrazioni elevate è assai tossica, ma a concentrazioni più basse è un metabolita chiave in quanto serve in reazioni che la convertono in composti organici azotati ENZIMI: A) GLUTAMMATO-DEIDROGENASI B) GLUTAMMINA-SINTETASI C) GLUTAMMATO-SINTASI B  3A

GLUTAMMATO DEIDROGENASI: aminazione riduttiva dell’ -chetoglutarato

GLUTAMMINA SINTETASI: produzione dell’azoto ammidico biologicamente attivo glutammato glutammina

I cloroplasti realizzano una riserva di azoto in forma di Glutammina attraverso la reazione catalizzata della Glutammina-sintetasi. Questo enzima possiede una affinità per NH4+ di oltre 3 volte superiore di quella della Glutammato-deidrogenasi Per questo si attribuisce all’enzima, oltre ad una funzione assimilatrice, anche una funzione “disintossicante” dei cloroplasti onde evitare un eccesso di NH4+ (disaccoppiante della fotofosforilazione in vitro)

LA TRANSAMINAZIONE  La transaminazione gioca un ruolo molto importante nel metabolismo degli amminoacidi in quanto costituisce una via per la ri-distribuzione dell’azoto amminoacidico Il GLUTAMMATO costituisce l’amminoacido chiave nel processo di transaminazione Le reazioni di transaminazione sono catalizzate da enzimi detti TRANSAMINASI, che utilizzano come cofattore il PIRIDOSSAL FOSFATO

chetoacido  amminoacido -chetoglutarico glutammico ossalacetico aspartico gliossilico glicina piruvico alanina idrossi-piruvico serina glutammato -semialdeide ornitina succinato semialdeide aminobutirrico -cheto ß-idrossibutirrico treonina