Corso di Laboratorio di Chimica Analitica SICSI VIII Ciclo A.A. 2008/2009 SPETTROFOTOMETRIA Corso di Laboratorio di Chimica Analitica Prof. S. Andini

Spettrofotometria Il termine spettrofotometria designa lo studio dell’assorbimento di radiazioni elettromagnetiche da parte della materia. Si tratta di un termine più specifico del termine generale spettroscopia elettromagnetica, in quanto la spettrofotometria si occupa di radiazioni che vanno dal vicino ultravioletto al vicino infrarosso e di luce visibile.

Destinatari Alunni iscritti al III anno di un Istituto Tecnico ad Indirizzo Chimico

Natura di una radiazione elettromagnetica Prerequisiti

Prerequisiti l=c/v ENERGIA DI UNA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA Una radiazione elettromagnetica consiste in “pacchetti discreti” di energia chiamati FOTONI, la cui energia dipende dalla frequenza, secondo l’equazione: E=h*v h indica la costante di Planck: h=6,63x10-34 J .s C= velocità della luce, uguale a 2,998x10-10 cm . sec-1 l=c/v I Diversi tipi di radiazioni elettromagnetiche

Obiettivi Raggiungimeto di un buon livello di conoscenza della spettroscopia UV-Visibile Comprensione dell’importanza della spettrofotometria come tecnica analitica di determinazione quali-quantitaviva delle diverse sostenze Applicazione pratica della legge di Lambert-Beer

Lo Spettro Elettromagnetico Lo spettro elettromagnetico è costituito dall’ordinata sequenza delle radiazioni secondo la loro lunghezza e frequenza d’onda

Spettri e Colori I metodi di analisi spettrochimici sono basati sull’analisi dello spettro elettromagnetico ottenuto da sostanze, esso può essere di emissione o di assorbimento Una sostanza investita da luce bianca ci appare colorata perché assorbe alcune radiazioni e ne trasmette delle altre, le quali appariranno con un colore che è la risultane delle radiazioni non assorbite

LUCE MONOCROMATICA E POLICROMATICA La luce bianca è in realtà un miscuglio di radiazioni di diversa frequenza e lunghezza d’onda, si parla in questo caso di un fascio di luce policromatica Si parla di un fascio di luce monocromatica quando esso è costituito da radiazioni di una sola frequenza e lunghezza d’onda

(Provetta che contiene Spettrofotometro Cuvette (Provetta che contiene il campione) A= -logT T= I/I0 Luce uscente Soluzione Luce entrante Sorgente (Emette radiazioni elettromagnetiche)

Caratteristiche dell’ assorbimento Assorbimento: processo in cui i fotoni interagendo con atomi e molecole determinano transizioni da uno stato “fondamentale” di energia ad uno “eccitato” M + h → M* Distinguiamo due tipi di assorbimento: Atomico Molecolare

Transizioni elettroniche e fotoni L’energia di un fotone assorbita da un atomo può determinare il passaggio di elettroni verso livelli energetici superiori

Assorbimento Molecolare Più complesso dell’assorbimento atomico perchè in una molecola bisogna considerare: Transizioni elettroniche Transizioni vibrazionali Transizioni rotazionali

Ad ogni livello elettronico possono essere associati più livelli vibrazionali e ad ognuno di questi più livelli rotazionali.

Spettro di assorbimento molecolare del Benzene in fase gas Transizioni elettroniche Transizioni vibrazionali Bande di assorbimento

Legge di Lambert-Beer l C l A= ε x l x C

Tipi di Spettrofotometro Spettrofotometro monoraggio Spettrofotometro a doppio raggio

Sorgenti Per la regione del visibile si utilizzano lampade ad incandescenza (a filamento di Tungsteno, lampade quarzo-iodio o lampade tungsteno-alogeno) Per la regione UV si usano lampade a scarica in un gas (deuterio o a idrogeno) Gli spettrofotometri UV-vis avranno quindi al loro interno due diverse lampade che vengono intercambiate dal meccanismo interno Per la regione IR si usano barrette di vari materiali, sempre riscaldate elettricamente a temperatura

DIVERSI TIPI DI CUVETTE VETRO O PLASTICA (VISIBILE) QUARZO (ULTRAVIOLETTO)

RIVELATORE, RIELABORAZIONE E PRESENTAZIONE DEI DATI Il rivelatore è un dispositivo capace di produrre un segnale elettrico che dipende dall'energia delle radiazioni ricevuta. Il segnale elettrico (proporzionale all'intensità luminosa) viene opportunamente amplificato ed un amperometro ne rileva l’intensità. Tramite un convertitore digitale è possibile ottenere i risultati dell’analisi direttamente su un personal computer che ne elabora i dati.

Proprietà di assorbimento delle bio-molecole Acidi nucleici (DNA, RNA): Assorbimento massimo compreso tra 250 e 270 nm Proteine: I residui amminoacidici Tirosina e Triptofano, contenuti in una proteina, presentano un massimo di assorbimento a 280 nm Proprietà di assorbimento delle bio-molecole Molecole con assorbimento nell’UV Acidi nucleici (DNA, RNA) Aminoacidi Proteine

Spettro di assorbimento delle basi del DNA Assorbanza Lunghezza d’onda (nanometri)

Spettro di assorbimento di alcuni amminoacidi Assorbanza Lunghezza d’onda (nanometri) Lunghezza d’onda (nanometri)

Spettro di assorbimento del DNA e delle proteine Proteina Assorbanza Assorbanza Lunghezza d’onda (nanometri) Lunghezza d’onda (nanometri)

Biomolecole con assorbimento nel visibile Spettro di assorbimento dell’emoglobina Lunghezza d’onda (nanometri)

Determinazione della Concentrazione della Sostanza in Esame METODO DIRETTO C= A/ (ε x l) A= ε x l x C l ε = A0/(l x C0) METODO DELLA RETTA DI LAVORO

Limiti della legge di Lambert e Beer