Il dogma centrale della biologia molecolare moderna Traduzione Trascrizione DNA RNA Proteina Watson pag 31 Le frecce indicano la direzione proposta x il trasferimento dell’informazione genetica. La freccia intorno al DNA evidenzia il fatto che il DNA è lo stampo x la sua autoreplicazione Replicazione

DOGMA CENTRALE Un gene è una sequenza di DNA che produce un’altro acido nucleico l’RNA Il DNA consiste di due filamenti polinucleotidici L’RNA consiste di un solo filamento polinucleotidico La sequenza dell’RNA è determinata dalla sequenza del DNA Un gene è una sequenza di DNA che codifica per un RNA In molti casi ma non in tutti l’RNA viene poi utilizzato per produrre direttamente una proteina Nei geni che specificano per proteine l’RNA a sua volta codifica per una catena proteica

Un gene codifica per un RNA che può codificare per una proteina Gli acidi nucleici sono le molecole contenenti l’informazione necessaria per costruire un’organismo Le caratteristiche ereditarie di ogni organismo vivente sono definite dal suo “genoma” Il genoma è l’insieme completo delle sequenze che costituiscono il materiale genetico di un’ organismo Comprende le sequenze del DNA cromosomico + qualunque sequenza di DNA presente negli organelli Un genoma si suddivide dal punto di vista fisico in cromosomi e da quello funzionale in geni Gene compatto pag 4 Si parla di informazione perché il genoma di per se non svolge nessun ruolo attivo nella costruzione dell’organismo è piuttosto la sequenza delle singole subunità dell’acido nucleico a determinare le caratteristiche ereditarie. Ogni cromosoma è un’unità fisica indipendente, contenente una sequenza di DNA che comprende molti geni Un gene codifica per un RNA che può codificare per una proteina

i procarioti sono i più semplici organismi cellulari. Sono rappresentati dagli eubatteri e archebatteri Le cellule eucariotiche sono definite dalla presenza di due compartimenti: il nucleo che contiene il materiale genetico ed il citoplasma che contiene numerosi organelli circondati da membrana (ad esempio i mitochondri, i lisosomi, l’apparato di Golgi) non presenti nei procarioti.

EUCARIOTI PROCARIOTI

Il DNA e l’RNA sono polimeri La struttura degli Acidi Nucleici Il DNA e l’RNA sono polimeri costituiti da monomeri nucleotidici composti da: 1. un gruppo fosfato 2. uno zucchero a 5 atomi di carbonio 3. una base azotata (tra 4 tipi diversi) Ribonucleotide Deossiribonucleotide

La struttura degli Acidi Nucleici Legame fosfoesterico Legame glicosidico

Nucleosidi Nucleotidi Una base azotata unita a un pentoso costituisce un nucleoside Nucleotidi L’insieme base azotata-zucchero-fosfato costituisce un nucleotide

I nucleotidi hanno molte altre funzioni: Ad esempio: L’ATP è una molecola ricca di energia in quanto la sua unità trifosfato contiene due legami fosfoanidridici ad “alto contenuto energetico” Serve da deposito di energia per i processi cellulari. L’idrolisi di ATP fornisce l’energia necessaria per spingere molte importanti reazioni cellulari: E’ una fonte di energia per la motilità delle cellule, per la generazione di movimento, per il trasporto attivo di molecole attraverso le membrane cellulari. L’ATP è anche un effettore allosterico di molti enzimi.

Zucchero Il deossiribosio e il ribosio sono zuccheri a 5 atomi di carbonio presenti negli acidi nucleici. Il deossiribosio differisce dal ribosio per l’assenza del gruppo ossidrilico sulla posizione 2 dell’anello. 2

Basi azotate Ogni acido nucleico contiene quattro tipi di basi. Le due purine, ADENINA E GUANINA, sono presenti sia nel DNA che nell’RNA. Le due pirimidine presenti nel DNA sono la CITOSINA e la TIMINA; nell’RNA la timina è sostituita dall’ URACILE. L’unica differenza tra uracile e timina è data dalla presenza di un gruppo metilico nella posizione C5 della timina.

Perché il DNA contiene timina? La Citosina si trasforma spontaneamente per deamminazione in Uracile Nel DNA, enzimi di riparazione possono riconoscere queste "mutazioni" sostituendo uracili con citosine … ma non distinguerebbero uracili naturali da quelli “mutati” Il problema è risolto usando TIMINA (5-metil-uracile)

IL LEGAME TRA NUCLEOTIDI 1 2

La catena polinucleotidica del DNA UN ACIDO NUCLEICO CONSISTE IN UNA SEQUENZA DI NUCLEOTIDI. Lo scheletro della catena polinucleotidica è formato da residui di zucchero e di fosfato alternati. La posizione 3’ di un anello di pentoso è legata alla posizione 5’ del pentoso successivo mediante un gruppo fosfato. Lo scheletro di zucchero-fosfato consiste in legami fosfodiesterici 5’-3’. Le basi azotate sporgono fuori dallo scheletro.

Il legame fosfodiesterico crea un’impalcatura ripetitiva zucchero-fosfato, che è una caratteristica strutturale del DNA COSTANTE L’ordine delle basi lungo la catena, al contrario, è CASUALE I legami fosfodiesterici conferiscono una ben definita polarità alla catena del DNA Le catene di DNA hanno una estremità detta 5’ ed un’altra estremità detta 3’

Il significato di 5’ e 3’ 5’ = carbonio dello zucchero a cui è attaccato il gruppo funzionale fosfato (PO4) 3’ = carbonio dello zucchero a cui è attaccato il gruppo funzionale ossidrile (OH) Per convenzione le sequenze del DNA vengono scritte e lette sempre a partire dalla terminazione 5’ verso la terminazione 3’ con un fosfato al 5’ ed un ossidrile al 3’ Il legame fosfodiesterico 3’-5’ unisce i nucleotidi

La struttura degli Acidi Nucleici Gli esperimenti di diffrazione dei raggi X condotti da Rosalind Franklin e Maurice Wilkins nel 1953 portarono alla ipotesi che il DNA avesse una struttura elicoidale ed anche composta da più di una catena polinucleotidica. Rosalind Franklin 1920-1958

La struttura degli Acidi Nucleici Nei primi anni 50 Erwin Chargaff condusse una serie di esperimenti sulla composizione degli acidi nucleici, e scoprì che non contenevano una uguale composizione dei 4 nucleotidi. Idrolizzando il DNA con acidi forti nei suoi nucleotidi componenti scoprì che A=T e G=C, e che G+C variava un funzione dell’organismo considerato. Dedusse quindi che A si appaia con T, e C con G. 1905-2002

La struttura degli Acidi Nucleici La doppia elica è composta da due catene polinucleotidiche che sono tenute insieme da deboli legami non covalenti che si instaurano tra le coppie di basi

Le basi formano le coppie con una polarità opposta Le due catene della doppia elica hanno sequenze complementari L’Adenina di una catena è sempre appaiata con la Timina dell’altra catena La Guanina di una catena è sempre appaiata con la Citosina dell’altra catena Le basi formano le coppie con una polarità opposta La base al terminale 5’ di un filamento è appaiata con la base al terminale 3’ dell’altro filamento I due filamenti della doppia elica sono tenuti insieme dall’appaiamento delle basi con un’orientazione anti-parallela

LE COPPIE DI BASI DEL DNA Le due coppie di basi hanno la stessa forma e lo stesso ingombro trasversale Gli zuccheri sono posizionati in modo da avere una distanza non dissimile nelle due coppie Doppio asse di simmetria che relaziona i 2 zuccheri e le 4 basi Le coppie di basi possono impilarsi l’una sull’altra. E’ energeticamente favorita la disposizione delle basi all’interno della doppia elica

IMPILAMENTO DELLE BASI a) Molecole contenenti anelli aromatici tendono a disporsi spontaneamente impilate come colonne di monete b) Le basi azotate a pH neutro sono idrofobiche e poco solubili in H2O IN UNA CATENA NUCLEOTIDICA LE BASI SI IMPILANO DISPONENDOSI PARALLELAMENTE FRA DI LORO L’IMPILAMENTO RIDUCE IL CONTATTO DELLE BASI CON L’ H2O E STABILIZZA LA STRUTTURA DEGLI AC. NUCLEICI Allison pag 19

La struttura degli Acidi Nucleici l Legami Idrogeno Sono legami che comportano la condivisione di un Idrogeno da parte di due atomi elettronegativi come Ossigeno e Azoto. Sebbene individualmente siano molto deboli conferiscono stabilità strutturale ad una molecola che ne possiede un grande numero (DNA) La formazione di legami idrogeno fra le basi è chiamata APPAIAMENTO DELLE BASI COMPLEMENTARI o di “Watson e Crick” La coppia di basi C-G è tenuta insieme da tre legami idrogeno La coppia di basi A-T è tenuta insieme da due legami idrogeno

Il legame idrogeno è importante nel determinare la specificità delle coppie di basi Contribuisce alla stabilità termodinamica dell’elica Contribuisce alla specificità delle coppie di basi 6 4 1 3 H2O A A Incompatibilità della coppia A:C Non si formano appropriati legami idrogeno La coppia fra queste basi risulta instabile

La struttura degli Acidi Nucleici La stabilità della doppia elica non è dovuta esclusivamente ai legami a idrogeno, ma anche dai legami che si istaurano dovute a interazioni di van der Waals e interazioni idrofobiche. Le interazioni di van der Waals si istaurano tra atomi neutri e sono piuttosto deboli. Diventano importanti se sono numerose e contribuiscono a realizzare interazioni specifiche ma reversibili. Le interazioni idrofobiche in soluzione acquosa sono un importante tipo di legame di van der Waals e rispecchiano la tendenza dei gruppi a-polari ad avvicinarsi tra loro escludendo l’acqua.

La struttura degli Acidi Nucleici James Watson e Francis Crick nel 1953 propongono un modello per la struttura tridimensionale del DNA. Vincono il premio Nobel nel 1962 (insieme a Wilkins).

Alcune osservazioni hanno portato alla costruzione del modello della doppia elica del DNA, proposto da Watson and Crick nel 1953:

La densità del DNA suggeriva che l’elica fosse costituita da due catene polinucleotidiche.

Il diametro costante dell’elica si poteva spiegare assumendo che le basi su ogni catena fossero affacciate verso l’interno e avessero limitate possibilità di combinazione una grossa base purinica si trova sempre di fronte a una piccola base pirimidinica IMPOSSIBILI le combinazioni purina-purina (troppo larga) pirimidina-pirimidina (troppo stretta).

la proporzione di A è sempre uguale a quella di T. Indipendentemente dalla quantità in cui ogni base è presente nel DNA, la proporzione di G è sempre uguale a quella di C la proporzione di A è sempre uguale a quella di T.

I dati della diffrazione dei raggi X hanno mostrato che il DNA ha la forma di un’elica regolare. Un giro dell’elica è lungo 34 Å (3.4 nm), con un diametro di ~20 Å (2 nm). Poiché la distanza tra nucleotidi adiacenti è 3.4 Å, ogni giro dell’elica contiene circa 10 nucleotidi.

La struttura degli acidi nucleici Ogni coppia di basi è ruotata di ~36° intorno all’asse dell’elica rispetto alla coppia successiva. Quindi ~10 coppie di basi portano ad una rotazione completa di 360°. L’avvolgersi dei due filamenti l’uno sull’altro dà origine a una doppia elica con un SOLCO MINORE (~12 Å di larghezza) SOLCO MAGGIORE (~22 Å di larghezza). La doppia elica è DESTRORSA, cioè si avvolge in senso orario intorno all’asse.

se ci sono meno coppie di basi per giro d’elica, essa è detta LA STRUTTURA DEL DNA PUÒ CAMBIARE LOCALMENTE. A livello di certe regioni vi possono essere variazioni dovute alla particolare sequenza delle basi o a condizioni imposte dall’ambiente. Se ci sono più coppie di basi per giro d’elica, la struttura è detta OVERWOUND; se ci sono meno coppie di basi per giro d’elica, essa è detta UNDERWOUND. L’avvolgimento locale può essere influenzato dalla conformazione globale della doppia elica o dal legame di proteine a specifici siti.

La struttura più comune della doppia elica del DNA in vivo: la forma B Nella forma B del DNA, il solco maggiore costituisce un’importante regione di contatto per le proteine che si legano specificamente a certe sequenze del DNA. Il solco minore è un importante target per alcune proteine regolatrici e strutturali, specialmente quelle che sono in grado di deformare il DNA così che il solco minore diventa più espanso.

Il solco maggiore fornisce molte informazioni di tipo chimico Le coppie di basi sono lette in codice in modo specifico I gruppi chimici esposti nei solchi costituiscono l’alfabeto del codice L’alfabeto è letto come la successione di donatori ed accettori di legami idrogeno, superfici di van der Waals, gruppi metilici A accettore D donatore M metile H idrogeno non polare Es. MADA = coppia T-A Es. ADAM = coppia A-T Le proteine possono riconoscere (leggere) senza ambiguità specifiche sequenze di DNA senza aprire o rompere la doppia elica

La doppia elica esiste in conformazioni multiple

LA MAGGIOR PARTE DELL’RNA ED I DUPLEX DNA-RNA ASSUMONO LA FORMA A Conformazione B (DESTRORSA) LA STRUTTURA PIÙ COMUNE DEL DNA IN VIVO Struttura più stretta e più allungata della forma A Ha un solco maggiore largo, facilmente accessibile alle proteine Ha un solco minore stretto Conformazione favorita ad alte concentrazioni di acqua (l’idratazione del solco minore sembrerebbe favorire la forma B si ottiene ad elevati valori di umidità relativa 92%) Le coppie di basi sono quasi perpendicolari all’asse dell’elica Conformazione A (DESTRORSA) LA MAGGIOR PARTE DELL’RNA ED I DUPLEX DNA-RNA ASSUMONO LA FORMA A Struttura più larga e più corta della forma B Ha un solco maggiore profondo, stretto, quindi non facilmente accessibile alle proteine Ha un solco minore largo, poco profondo, accessibile alle proteine Conformazione favorita a basse concentrazioni di acqua la disidratazione della forma B alla forma A

Conformazione Z (SINISTRORSA) E’ L’UNICA DOPPIA ELICA SINISTRORSA Può formarsi in vivo e richiede una sequenza specifica. La sua funzione rimane ignota. Struttura più stretta e più allungata della forma A e B Il solco maggiore è appiattito sulla superficie dell’elica in modo tale da non risultare in maniera distinta. Il solco minore è stretto Conformazione favorita ad alta concentrazione salina; Si riscontra nei polinucleotidi la cui sequenza consiste in purine alternate a pirimidine generalmente tratti di DNA ricchi di basi C e G .Tipica delle sequenze che presentano modificazioni chimiche come la metilazione Le coppie di basi sono quasi perpendicolari all’asse dell’elica Si riscontra nei polimeri costituiti dalla sequenza ripetuta GpC Lo scheletro di zucchero-fosfato descrive un percorso a zigzag lungo l’elica

LE MOLECOLE RAPPRESENTATE IN FIGURA SONO COSTITUITE DALLO STESSO NUMERO DI BASI, EVIDENZIANDO IL DIVERSO GRADO DI COMPATTEZZA DELLE DIVERSE FORME DI DNA

Denaturazione del DNA I due filamenti della doppia elica sono tenuti insieme mediante legami relativamente deboli (non-covalenti). La stabilità di un duplex è funzione della temperatura A temperature alte è favorita la denaturazione A temperature basse è favorita la doppia elica La “temperatura di melting” Tm, o “punto di fusione” corrisponde alla temperatura alla quale il 50% delle molecole è sotto forma di doppia elica La Tm dipende dal rapporto (G+C) / (A+T) perché la coppia di basi G-C ha più legami idrogeno (3) di quella A-T (2)

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