Fertilizzazione in vitro: Tecnica convenzionale (IVF) Scuola di Specializzazione in Fisiopatologia della Riproduzione degli Animali Domestici Corso di Biotecnologie della Riproduzione Animale AA 2016/17 Fertilizzazione in vitro: Tecnica convenzionale (IVF) Prof.ssa ME Dell’Aquila

Sommario (1) Fisiologia della fertilizzazione IVF: Aspetti storici IVF in animali domestici (aspetti commerciali) Aspetti legati alla ricerca

Sommario (2) IVF come terapia dell’infertilità nell’uomo Procedure in vitro (con ovociti maturati in vivo/vitro) Valutazione efficienza procedure in vitro Anomalie della fertilizzazione Test in vitro per capacità fecondante del seme e per fertilizzabilità dell’ovocita

Introduzione La fertilizzazione è un processo complesso nel quale si verifica l’unione tra due gameti, il ripristino dell’assetto cromosomico diploide e si avvia lo sviluppo di un nuovo individuo. Il successo della fertilizzazione dipende da appropriate preparazioni dei due gameti e dal definire adeguate condizioni di coltura favorevoli alle attività metaboliche dei due gameti

Fisiologia della fertilizzazione Sito del processo di fertilizzazione in vivo L’interazione spermatozoo-ovocita La fertilizzazione è un processo temperatura-dipendente Vita media dei gameti nell’ovidutto Dispersione delle cellule del cumulo ooforo Percentuali di fertilizzazione in vivo

Sito della fertilizzazione La fertilizzazione in vivo si verifica nel tratto ampollare delle tube uterine (tube di Falloppio o ovidutti)

Sequenza degli eventi della fertilizzazione nei mammiferi

Binding spermatozoo-ovocita e successiva fusione dei due gameti

Interazione spermatozoo-ovocita ZP3 Superficie ZP recettore primario per lo spermatozoo ZP2 Interno della ZP recettore secondario per lo spermatozoo - PH20/2B1 forma di ialuronidasi (reg post-acrosom) - B 1,4 GalT-I membrana plasmatica spermatozoo media legame con gruppi glucidici proteine della ZP - SP56 membrana plasmatica spermatozoo recettore primario per l’ovocita - PRO-ACROSINA membrana acrosomiale interna recettore secondario per l’ovocita - Fertilina membrana plasmatica spermatozoo, media legame con oolemma SPERMATOZOO

IVF: aspetti storici Chang, 1968 (IVF/progenie in conigli) Iritani e Niwa, 1977 (IVM/IVF in bovini) Edwards and Steptoe, 1978 (IVF in umana) Brackett et al., 1982 (IVF/progenie in bovini) Cheng et al., 1986 (IVM/IVF/progenie in ovini) Hanada et al., 1986 (IVM/IVF/progenie in bovini) Lu et al., 1987 (IVM/IVF/IVC/progenie in bovini)

La fertilizzazione in vitro in medicina riproduttiva umana Edwards e Steptoe, 1978 (IVF, Luise Brown) Chen, 1986 (IVF con ovocita congelato) Winston e Handyside, 1993 (casistiche) Trounson et al., 1994 (IVM-IVF)

Procedura di IVF Preparazione dell’ovocita Valutazione della qualità spermatica Swim up/Percoll gradient/filtrazioni Lavaggi e dosi del seme Fattori che favoriscono la motilità spermatica: caffeina, glutatione, PHE, PAF, pentoxiphillin Sistema di coltura in TALP (Tyrode’s albumin-lactate-pyruvate) medium

Descrizione degli stadi di sviluppo dei pronuclei maschili e femminili Maschile Femminile PN-1 spz intatto PN-2 spz inizio decondensazione PN-3 ulteriore decondensazione PN-4 formazione due PN sferici PN-5 ampliamento delle dimensioni dei PN PN-6 Massima misura e singamia PN-1 MII PN-2 estrusione II PB PN-3 decondensazione della MII

Zigote umano osservato in vivo Valutazione dell’efficienza delle procedure di IVF Zigote umano osservato in vivo

Zigote equino osservato dopo fissaggio in formalina e colorazione con Hoechst 33258 (2.5 mg/ml)

Trattamenti post-inseminazione Trasferimento dei presunti zigoti al terreno di coltura embrionale Trattazione rinviata alla lezione sulla coltura embrionale

Anomalie della fertilizzazione Fertilizzazione ritardata 2PB, 1 PN e residui spermatici 1PB, MII, 0PN e swollen sperm head Fertilizzazione anomala 1PB, 3PN Polispermia

Test di fertilità in vitro del seme Il sistema di fertilizzazione in vitro viene impiegato per testare la capacità fecondante del seme ottenere dati complementari a quelli in campo (per animali zootecnici) o in clinica (nell’uomo).

IVF:Letture consigliate “Developments in embryo in vitro production technology” and “In vitro fertilization” In I. Gordon. Laboratory production of cattle embryos. CABI publishing. Cap.1-6. Parmigiani et al., 1997. Ovum pick up (OPU), fertilizzazione (IVF) e coltura in vitro di embrioni nella specie bovina. Large An Rev 4:23-31.