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Attività del partner (OR4): «Realizzazione di una piattaforma tecnologica in grado di processare una soluzione di prodotto finito al fine di rilevare ed eliminare contaminanti chimici e biologici» (soggetto attuatore AMOLAB e CNR) ATTIVITA’ 4.6 Studi di tossicità in vitro del radiofarmaco Ga-68 DOTATOC a monte e a valle del processo di purificazione operato dalla piattaforma tecnologica sperimentale

Attività svolte Selezione di linee cellulari idonee per lo svolgimento dei test di citotossicità Verifica della tossicità in vitro del radiofarmaco Ga-68 DOTATOC tramite test metabolici e biochimici: Test MTT Misura della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) Dosaggio dell’attività della Caspasi-3 (apoptosi) Dosaggio dell’attività della Lattico Deidrogenasi (necrosi)

Allestimento di colture di diverse linee cellulari e caratterizzazione delle rispettive curve di crescita Dopo uno screening iniziale, sono state selezionate quattro linee cellulari diverse per derivazione embriologica ma con simili caratteristiche proliferative. HepG2: carcinoma epatocellulare; HeLa: carcinoma della cervice uterina; SKOV-3: carcinoma ovarico; MG-63: osteosarcoma.

Test MTT Il test MTT si basa sull’utilizzo del composto bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, ed è un test colorimetrico standard per la misurazione dell'attività degli enzimi che riducono l'MTT a formazano. Questa reazione ha luogo prevalentemente nei mitocondri delle cellule vive, dove l'anello di tetrazolio dell'MTT (sostanza di colore giallo) viene tagliato dando origine al formazano (un sale blu). Tale reazione è misurata mediante la lettura spettrofotometrica del campione, alla lunghezza d'onda di 570 nm. Sebbene sia un test comunemente utilizzato per valutare la citotossicità di farmaci o altri tipi di sostanze chimicamente attive e potenzialmente tossiche, è considerato tuttavia un test di primo livello a causa della sua relativamente bassa specificità, e di solito viene affiancato da altri saggi di maggiore specificità. Per l’esecuzione del test le cellule sono state incubate da 6h a 72h in presenza di Ga-68 DOTATOC a concentrazioni variabili tra 0 e 100 ng/mL. Tale intervallo di concentrazioni è stato scelto tenendo conto della diluizione della soluzione di farmaco quando iniettata nel torrente circolatorio, e di possibili fenomeni di accumulo del farmaco nelle cellule bersaglio.

Effetto del Ga-68 DOTATOC nativo sulla vitalità delle linee cellulari selezionate Soglia di citotossicità (Protocollo Internazionale ISO 10993-5)

Effetto del Ga-68 DOTATOC purificato sulla vitalità delle linee cellulari selezionate Soglia di citotossicità (Protocollo Internazionale ISO 10993-5)

Risposta delle linee cellulari selezionate a composti chimici di tossicità nota Al fine di verificare la sensibilità alla tossicità chimica delle linee cellulari selezionate si sono condotti, come controllo positivo, esperimenti di “viability assay” dopo trattamento delle cellule con un nanoparticolato di tossicità accertata costituito da nanotubi di alluminosilicato (HNT). Soglia di citotossicità (Protocollo Internazionale ISO 10993-5)

Misura della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) Le specie reattive dell'ossigeno, i ROS, includono l'anione superossido (O2-), il perossido d'idrogeno (H2O2) e il radicale ossidrilico (•OH). In condizioni normali le cellule producono bassi livelli di ROS, tramite vari processi, che sono tollerati e vengono inattivati da sistemi enzimatici antiossidanti detti “scavenger” per la loro capacità di neutralizzarli. Quando la produzione di ROS è eccessiva si genera una condizione di stress ossidativo, in cui gli antiossidanti non riescono più a neutralizzarli generando un danno cellulare che può essere sia reversibile, con ritorno della cellula torna alle condizioni normali, o irreversibile, con conseguente morte cellulare per apoptosi o per necrosi.

Effetto del Ga-68 DOTATOC sulla produzione di Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS) La produzione di perossido di idrogeno è stata misurata tramite saggio colorimetrico utilizzando il substrato OxiRed™ che, in presenza di H2O2 e dell’enzima perossidasi, viene convertito in un prodotto colorato rilevabile con lettura spettrofotometrica alla lunghezza d'onda di 570 nm. Le cellule sono state incubate per 72h in assenza (Ctrl) e in presenza (Ga-68 DOTATOC) di farmaco alla concentrazione di 100 nM. L’analisi quantitativa è stata ottenuta tramite aggiunta di una soluzione standard di H2O2 (15 nmoli).

Dosaggio dell’attività della Caspasi-3 (apoptosi) L’apoptosi è un fenomeno controllato geneticamente che determina la morte programmata di una cellula a un certo punto del suo ciclo vitale. Svolge un ruolo molto importante sia in processi fisiologici, quali lo sviluppo dei tessuti ed il mantenimento dell’omeostasi cellulare, che patologici quali infezioni virali, condizioni di stress, danni al DNA, ed è caratterizzato da alterazioni morfologiche e funzionali delle cellule del tutto peculiari. Dal punto di vista biochimico, l’apoptosi si caratterizza per l’attivazione a cascata di particolari enzimi: le caspasi. In seguito ad uno stimolo apoptotico specifico si ha l’attivazione delle caspasi 8, 9 e 10 (caspasi iniziatrici) che, a loro volta, attivano la caspasi 3 responsabile della fase esecutiva vera e propria dell’apoptosi.

Effetto del Ga-68 DOTATOC sull’attività della Caspasi-3 L’attività della caspasi-3 è stata misurata tramite test colorimetrico, utilizzando un substrato peptidico derivatizzato con il cromoforo p-nitroanilina (DEVD-pNA). In presenza di caspasi-3 attiva il cromoforo viene staccato dal peptide e diventa rilevabile spettrofotometricamente alla lunghezza d'onda di 405 nm. Le cellule sono state incubate per 72h in assenza (Ctrl) e in presenza (Ga-68 DOTATOC) di farmaco alla concentrazione di 100 nM. Il controllo positivo è costituito da cellule incubate in presenza dell’induttore di apoptosi Camptotecina alla concentrazione di 2 mM.

Dosaggio dell’attività della Lattico Deidrogenasi (necrosi) La necrosi, al contrario dell’apoptosi, è una forma di morte cellulare accidentale che si osserva raramente in condizioni fisiologiche, ed è la conseguenza di un grave evento traumatico subito dalla cellula. Una cellula che muore per necrosi va incontro a un rigonfiamento rapido e incontrollato che porta alla rottura della membrana plasmatica con conseguente fuoriuscita del contenuto intracellulare nell'ambiente extracellulare; a questo fenomeno consegue, molto spesso, a una risposta infiammatoria caratterizzata dall'aumento del flusso sanguigno nell'area interessata, dall'afflusso dei leucociti e dal rilascio di varie molecole che mediano la risposta infiammatoria. L’enzima citosolico Lattico Deidrogenasi è considerato un enzima “marker” di necrosi cellulare.

Effetto del Ga-68 DOTATOC sull’attività della Lattico Deidrogenasi (LDH) L’attività della Lattico Deidrogenasi è stata misurata tramite saggio colorimetrico, utilizzando una miscela di reazione contente acido lattico (substrato) e NAD+ (cromoforo). In presenza di LDH l’acido lattico viene ossidato ad acido piruvico con conseguente riduzione del NAD+ a NADH, quest’ultimo quantificabile spettrofotometricamente alla lunghezza d'onda di 340 nm. Le cellule sono state incubate per 72h in assenza (Ctrl) e in presenza (Ga-68 DOTATOC) di farmaco alla concentrazione di 100 nM. Il controllo positivo è costituito da cellule permeabilizzate con un blando detergente per favorire il rilascio del contenuto intracellulare.

CONCLUSIONI I risultati degli esperimenti di tossicità in vitro effettuati tramite test metabolico MTT indicano che, nelle condizioni sperimentali utilizzate, il Ga-68 DOTATOC induce una modesta riduzione della vitalità cellulare (10-15%), ben al di sotto del valore soglia del 30% fissato dalla norma ISO 10993-5; tali risultati sono stati pienamente confermati anche dai risultati dei test biochimici a più elevata specificità quali il dosaggio della produzione di ROS, dell’attività della caspasi-3 e della lattico deidrogenasi; Il passaggio del Ga-68 DOTATOC attraverso la piattaforma tecnologica non ne modifica gli effetti in maniera significativa.