La replicazione dei virus (dal virus parentale ai virus della progenie)

Prerequisito indispensabile: Essendo PARASSITI ENDOCELLULARI OBBLIGATI i virus devono trovare, entrare in contatto e penetrare in una cellula ospite dentro la quale si possa svolgere il ciclo replicativo La replicazione virale richiede quindi obbligatoriamente l’infezione di una cellula ospite; ed ogni virus ha un ristretto "spettro d’ospite".

La replicazione di un virus si può dividere in diverse fasi: Adesione del virus alla cellula Penetrazione del virus nella cellula Replicazione del genoma Assemblaggio delle neo-particelle Maturazione e rilascio dei virus neoformati

adsorbimento: ancoraggio del virione a specifici recettori sulla superficie cellullare per mezzo di siti stereochimicamente complementari (detti "antirecettori"). L’attacco del virus consiste nel riconoscimento specifico tra l’ antirerecettore virale e il recettore cellulare. Le molecole rettoriali possono essere: A) Proteine (di solito glicoproteine) di solito, recettori specifici B) Residui di carboidrati di solito, recettori meno specifici (presenti su glicoproteine o glicolipidi; la stessa configurazionedi catene laterali si può ritrovare su differenti molecole glicosilate delle membrane) Alcuni virus complessi usano più di un recettore e, quindi, hanno vie alternative di ingresso dentro le cellule. Ci sono diverse classi di recettori, come: le immunoglobuline o immunoglobuline-like i recettori associati alle membrane i trasportatori e i canali di transmembrana Un fattore che accomuna tutti i recettori virali: sono molecole di superficie le cui funzioni fisiologiche vengono sovvertite dai virus.

Co-recettori Alcuni virus hanno un processo a due tappe nell’attacco e penetrazione Step 1: bassa affinità del virus con il primo recettore che porta il virus in prossimità del secondo recettore Step 2: il secondo recettore promuove un un attacco maggiore e la fusione della membrana

Ingresso (penetrazione) I principali modi di penetrazione dei virus animali sono endocitosi e fusione Endocitosi: dell’ intero virus all’ interno di un vacuolo intracellulare Fusione: dell’ envelope virale con la membrana cellulare. Richiede la presenza di una proteina di fusione virale

scapsidamento: Evento che segue l’entrata del virus e precede la replicazione del genoma attraverso il quale il genoma virale si separa dalle proteine che lo rivestono. Il meccanismo può avvenire attraverso varie modalità ed è possibile che lo stesso virus possa seguire vie diverse a seconda delle situazioni e del tipo di cellula ospite. Per molti virus le proteine virali si disaggregano spontaneamente o con l’intervento di proteasi cellulari o enzimi lisosomiali che si riversano all’interno di vacuoli fagocitari(fagolisosomi o virosomi). Subito dopo, o contemporaneamente alla penetrazione, inizia la cosiddetta "fase di eclisse". In questa fase i virioni, perdendo la loro integrità strutturale, sembrano scomparire alle comuni indagini virologiche. Queste proprietà, tipiche dei virioni completi, ricompaiono solo in presenza della progenie virale.

fase replicativa che comprende: a. sintesi degli acidi nucleici virali; b. sintesi dell’RNA messaggero; c. sintesi delle proteine virali. La produzione dell’RNA messaggero è la fase fondamentale dell’espressione dell’informazione genetica virale e per sottolineare questo fatto alcuni autori hanno proposto di chiamarlo RNA a filamento (polarità) positivo (+). Di conseguenza i filamenti genomici complementari all’mRNA vengono considerati negativi (-). Strategie replicative dei genomi

Assemblaggio: L’ assemblaggio implica la raccolta di tutti i componenti necessari per la formazione del virione maturo in un punto particolare della cellula (viroplasma)dove si forma la struttura di base della particella virale Le particelle virali si assemblano spontaneamente senza bisogno di nessun altra informazione estranea. Le forze che guidano l’assemblaggio dei capsidi virali includono le interazioni idrofobiche ed elettrostatiche. Raramente si formano legami covalenti tra le subunità multiple. In termini biologici questo significa che vengono usate interazioni fra proteina - proteina, proteina - acido nucleico, proteina - lipidi. Il sito di assemblaggio dipende dal sito di replicazione e dal meccanismo usato dal virus per uscire dalla cellula Nella maggior parte( ma non in tutti) i virus a RNA l’assemblaggio avviene nel citoplasma Nella maggior parte( ma non in tutti) I virus a DNA l’assemblaggio avviene nel nucleo

maturazione: fuoriuscita dei virioni della progenie all’esterno della cellula ospite (a seconda dei virus può avvenire con la lisi della cellula oppure per gemmazione dalla membrana citoplasmatica, cioé in modo non traumatico per la cellula). Spesso non è possibile distinguere le fasi di assemblaggio, maturazione e rilascio e non sempre sono in questo ordine Gemmazione virale

Possibili danni dell’infezione virale : L’infezione di una cellula e replicazione virale L’infezione virale di una cellula può essere: - produttiva: il virus penetra in una cellula permissiva e si ha la formazione di progenie virale; - abortiva: il virus penetra in una cellula non permissiva e non si osserva la formazione di progenie virale; - restrittiva: la cellula risulta momentaneamente permissiva e ciò porta alla formazione di una piccola quantità di progenie virale; poco dopo la cellula diventa non permissiva, ma il genoma virale rimane presente nella cellula. Possibili danni dell’infezione virale : Infezione acuta con lisi delle cellule Infezione cronica/ persistente (la maggior parte delle cellule non sono uccise; non tutte le cellule sono infettate) Infezione latente con possibile riattivazione (il genoma virale può essere libero o integrato nel DNA della cellula ospite, ma in questo caso è espresso in modo molto limitato) -Trasformazione delle cellule (i geni virali interferiscono con i meccanismi di controllo della proliferazione cellulare e causano la neoplasia) Circa il 15% dei tumori umani ha un’eziologia virale associata; in gran parte associata a 2 neoplasie molto diffuse: tumori cervicali femminili (HPV) e tumori del fegato (HBV e HCV).

Possibili danni dell’infezione virale

Risposte difensive antivirali dell’ospite Meccanismi non immunitari: barriere anatomiche, pH, fagocitosi, interferenza virale Meccanismi immunitari: - azione protettiva preventiva con IgA secretorie, e con immunoglobuline circolanti( IgG e IgM) neutralizzanti e insieme al complemento opsonizzanti - azione antivirale cellulo-mediata con linfociti T-citotossici, cellule NK, e citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente

Interferenza virale (I) Quando due virus diversi infettano le stesse cellule, ambedue i virus possono replicarsi normalmente oppure un virus può impedire, o più spesso ridurre, la replicazione dell’altro. A quest’ultima eventualità si dà in nome di interferenza virale. I meccanismi alla base del fenomeno sono tre: 1) Interferoni. Dereprimendo i relativi geni cellulari, l’acido nucleico del virus interferente induce da parte della cellula la produzione di glicoproteine, dette interferoni( IFN), che esercitano un’azione inibente sulle biosintesi virali. E’ il meccanismo di interferenza virale più importante perché gli IFN, pur essendo notevolmente specie-specifici ( essendo, cioè, attivi quasi esclusivamente su cellule della stessa specie che li ha prodotti), non sono virus-specifici ( sono attivi anche su virus non correlati con quello che che ne ha indotto la secrezione) e anche perché, venendo secreti nell’ambiente extracellulare, rendono resistenti non solo le cellule invase da l virus interferente ma anche quelle circostanti o che comunque vengano esposte a concentrazione sufficienti della molecola. Sono state individuate tre classi di inteferoni denominati IFN alfa, IFN beta e IFN gamma, prodotti rispettivamente da leucociti, fibroblasti e linfociti T attivati dall’antigene( Gli IFN alfa e beta sono prodotti dopo 4-12 ore nelle infezioni virali, mentre l’IFN gamma ha un’azione principalmente immunoregolatrice e più tardiva)

Interferenza virale (II) 2) 3)

Chemioterapia BERSAGLI. Gli studi di virologia molecolare hanno identificato le diverse fasi del processo infettivo virus specifico al fine di individuare i bersagli per l’inibizione farmacologica. Teoricamente qualsiasi stadio del ciclo replicativo virale potrebbe essere il sito d’azione per una terapia: • l’attacco del virus alla cellula ospite, • lo scapsidamento del genoma virale, • la retrotrascrizione e l'integrazione (in alcuni virus), • la trascrizione virale, • la replicazione degli acidi nucleici virali, • la traduzione di proteine virali, • l'assemblaggio,la maturazione e il rilascio dei virioni. MECCANISMO D’AZIONE. I meccanismi dei vari farmaci variano molto. Talvolta il farmaco è attivato da enzimi cellulari prima di attivare l’inibizione della replicazione virale; i farmaci più selettivi sono attivati da enzimi codificati dal virus nella cellula infettata. CLASSI DI FARMACI. I farmaci antivirali possono essere divisi in: A. Analoghi dei nucleosidi B. Analoghi dei nucleotidi C. Inibitori della trascrittasi inversa D. Inibitori della proteasi GENERALITÀ. I virus, a differenza di batteri e protozoi, sono patogeni obbligati, devono cioè parassitare la cellula ospite per sfruttarne i meccanismi replicativi, per cui è stato molto difficile sviluppare farmaci che distinguessero i processi replicativi virali da quelli dell’ospite Gli agenti antivirali devono essere in grado di colpire selettivamente le diverse tappe dell’infezione virale. Inoltre il farmaco ideale dovrebbe ridurre i sintomi della malattia senza però modificare l’infezione così tanto da prevenire una risposta immune nell’ospite. I farmaci risultano essere importanti per quei virus per i quali non esiste una profilassi valida (vaccino). 19

Metodi per studiare i virus Si ricercano e si mettono in evidenza le caratteristiche dei virus. Ed i virus: Sono visibili (EM) Sono viventi (si replicano, fanno danni) Contengono antigeni Contengono acidi nucleici Hanno altre caratteristiche (emoagglutinazione,…)

Microscopia elettronica Microscopia elettronica su tessuto Pro e contro delle ME PROPRO semplice preparazione del campione rapida esecuzione CONTRO bassa sensibilità non distingue tra virus con uguale morfologia alti costi CORONAVIRUS

Isolamento e coltura Si seminano su colture cellulari in vitro Colture Cellulari è un termine che indica tutta una serie di procedure che permettono di coltivare "in vitro", ossia in una piastra o una fiasca di coltura, cellule animali e vegetali. Le colture si realizzano a partire da sospensioni di cellule dissociate dai tessuti Le colture preparate direttamente dai tessuti si dicono colture primarie o espianti. Da queste si possono prelevare le cellule per ricavarne colture secondarie; il processo può essere ripetuto più volte, e il numero dei "passaggi“( da 1 o 2 fino a 50) è in rapporto alla provenienza e all’età del tessuto. Le cellule embrionali sono quelle che possono essere trapiantate per un maggior numero di volte. Dopo un numero finito di replicazioni in coltura la maggior parte delle cellule dei vertebrati muore. Le colture cellulari continue possono derivare da tessuto canceroso oppure possono derivare da cellule diploidi coltivate, che durante i passaggi si ”trasformano”, divengono praticamente immortali, e possono essere trapiantate per un tempo illimitatato. Si osserva l’effetto citopatico Sincizi da VRS Oltre che su colture cellulari per far riprodurre i virus, in particolari casi, è possibile ricorrere ancora all’antico metodo dell’infezione di animali da esperimento e alla coltivazione su uovo embrionato

Ricerca degli antigeni virali con metodi immunochimici Cellule fibroblastiche positive per CMV in immunofluorescenza

Amplificazione degli acidi nucleici

PRIONI Con il termine Prioni s’intende una classe d’agenti infettivi distinta da virus, batteri, funghi, e altri agenti patogeni noti. Studi condotti sull’agente infettante dello scrapie (una malattia neurodegenerativa), hanno dimostrato che era privo di acidi nucleici e consisteva soprattutto in proteine. Questo perché i fattori che danneggiavano irreversibilmente gli acidi nucleici non riducevano l’infettività; mentre quelli che danneggiavano le proteine, la riducevano. Ulteriori studi stabilirono che i prioni dello scrapie contenevano una sola proteina chiamata proteina prionica o PrP. E’ stato individuato ed isolato nelle cellule di criceto e del topo un gene per la PrP; tale gene quindi non risiede nei prioni, ma nei cromosomi di tutti i mammiferi studiati. Per di più tutte queste specie, producono quasi costantemente PrP cellulare senza ammalarsi. Si è formulata allora l’ipotesi che la PrP possa esistere in due forme, una che genera la malattia e una che invece riveste altre funzioni tuttora sconosciute. Quest’ipotesi si è rivelata corretta poiché la PrP trovata nel cervello di animali infettati resiste alla degradazione da parte delle proteasi (enzimi in grado di denaturare le proteine), mentre la maggior parte delle proteine cellulari vengono facilmente degradate. Dunque, con il termine “PrP cellulare”, si indica la proteina normale; mentre con il termine “PrP dello scrapie”, si indica quella infettiva. Quest’ultimo termine è oggi usato per indicare le molecole proteiche che costituiscono i prioni, responsabili di tutte le malattie simili allo scrapie negli animali e nell’uomo. I prioni identificati nella vCJD ( variante o nuova variante della Malattia di Creutzdeldt-Jakob) hanno proprietà fisico-chimiche simili a quelli della BSE (Encefalopatia Spongiforme Bovina)

PRIONI Particelle infettive la cui forma extracellulare è interamente proteica. In generale, causano encefalopatie spongiformi trasmissibili Ma come e da cosa prodotte? dall'inglese prion (acronimo di "PRoteinaceus Infective ONly particle"=particella infettiva solamente proteica) Cambiamento conformazionale perdita di funzione, resistenza a proteasi, insolubilità  aggregati, sintomi neurologici