MICOBATTERI E TUBERCOLOSI • Nel 1993 l’OMS dichiarò la tubercolosi “Emergenza Mondiale”a seguito della ripresa della diffusione dell’epidemia; i fattori che hanno favorito e favoriscono tuttora l’espansione della malattia sono principalmente quattro: 1. La concomitante diffusione dell’HIV con il suo effetto devastante: infatti l’una favorisce il propagarsi dell’altra; un individuo HIV positivo presenta un rischio 100 volte superiore di ammalarsi di TBC, in quanto il deficit immunitario determinato dalla malattia, permette che altre infezioni possano essere acquisite; 2. L’aumento soprattutto negli ultimi decenni di spostamenti per viaggi, attività lavorative tra paesi anche molto distanti tra loro; 3. La scarsa opera di prevenzione e cura in particolar modo a livello delle fasce sociali a maggior rischio di infezione; 4. L’uso improprio dei farmaci che di fatto ha indotto la comparsa di ceppi batterici multi resistenti (MDR- TB)

MICOBATTERI • Ordine Actinomycetales • Famiglia Mycobacteriaceae • Genere Mycobacterium • >100 specie

MICOBATTERI CARATTERISTICHE Presentano un elevato contenuto di lipidi a livello della parete, che comporta: a) difficoltà di colorare questi batteri con il metodo di Gram ( non utilizzabile ai fini diagnostici); b) alcool-resistenza cioè capacità di legare un colorante rosso, la fucsina, e di resistere all’azione decolorante di un acido e dell’alcool (caratteristiche tintoriali evidenziabili con la colorazione di Ziehl-Neelsen). I micobatteri sono diffusi nel suolo, nelle acque e negli animali. La diffusione nell’ambiente è dovuta alla resistenza all’essiccamento e ai disinfettanti, imputabile all’alto contenuto di lipidi. Presentano un ritmo di crescita lento, per cui le indagini colturali necessitano di tempi di incubazione lunghi( più o meno lunghi a seconda delle specie) I micobatteri hanno tempi di replicazione assai più lunghi di quelli degli altri batteri. Mycobacterium leprae impiega per replicarsi circa un mese, Mycobacterium tuberculosis circa 20 ore; si tratta di tempi lunghissimi se si pensa che Escherichia coli si moltiplica ogni 20 minuti.

Classificazione del genere Mycobacterium “Gruppo tubercolare”( M. tuberculosis complex) responsabili della tubercolosi nell’uomo: M.tuberculosis hominis, M.bovis, M.africanum, M.microti MOTT (Mycobacteria other than tuberculosis) comprendenti: - patogeni opportunisti, tra cui: M.avium, M.intracellulare, M.scrofulaceum, M.simiae,… - micobatteri prevalentemente ambientali e che molto raramente causano malattia nell’uomo: M.gordonae, M.fortuitum, M.terrae, M.smegmatis,… M. leprae: responsabile della lebbra Raggruppamenti o complessi (complex) La sistematica non prevede entità intermedie tra genere e specie: nel genere Mycobacterium sono però largamente usati i raggruppamenti o complessi (complex): insieme di specie non facilmente differenziabili, nonché simili per il loro significato clinico. I più conosciuti sono il Mycobacterium tuberculosis complex e il Mycobacterium avium complex

EPIDEMIOLOGIA Grandi progressi sono stati fatti negli ultimi anni nel controllo della tubercolosi, ma molto rimane ancora da fare, soprattutto in Africa. Dall’ultimo rapporto dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) sul controllo globale della tubercolosi emerge un quadro complesso, contraddittorio, con elementi di ottimismo e altri di preoccupazione. La tubercolosi nel mondo è ancora un fenomeno estremamente rilevante: nel 2010 sono stati stimati 8,8 milioni di nuovi casi e 1,45 milioni di morti a causa della tubercolosi.

LA TUBERCOLOSI IN ITALIA NEGLI ULTIMI CINQUANT’ANNI Numero di casi e incidenza Nell’ultimo cinquantennio (1955-2008), il numero annuale di casi di TBC registrati dal sistema di notifica nazionale è passato da 12.247 a 4.418; il tasso grezzo annuale è passato da 25,26 casi per 100.000 abitanti a 7,41. Dal 1955 al 1981, la frequenza di TBC nella popolazione italiana si è ridotta progressivamente e drasticamente fino a raggiungere nel 1974 un tasso di incidenza di tubercolosi al di sotto di 10 casi per 100.000 abitanti. Negli ultimi venticinque anni il trend è stato sostanzialmente stabile, oscillando sempre intorno ai 7 casi per 100.000 abitanti (solo nel 1996 il tasso di incidenza torna ad avvicinarsi al valore soglia dei 10 casi per 100.000 abitanti). Il 73% dei casi totali notificati nel 2008 provengono da Lombardia, Lazio, Veneto, Emilia Romagna e Piemonte. Al contrario, le Regioni del Centro, del Sud e delle Isole evidenziano un trend in diminuzione (Sud e Isole nel 2008 hanno notificato solo il 10% dei casi totali a livello nazionale). Il 25% dei casi totali notificati a livello nazionale nel 2008 provengono dalle Province di Roma e Milano.

ANTIGENI Importanti, in particolare, gli Antigeni proteici: essi sono debolmente immunogeni, ma la loro attività viene potenziata dalle cere della classe D( una delle molecole lipidiche della parete), e sono responsabili dell’ipersensibilità ritardata svelata dal test della tubercolina

Trasmissione dell’infezione tubercolare la tubercolosi polmonare può trasmettersi per via aerea dalle goccioline espulse da persone malate che tossiscono o starnutiscono o comunque, parlando, espellono goccioline di saliva

Dall’esposizione alla malattia Fondamentale è il rapporto tra attività battericida dei mφ e virulenza dei bacilli Esposizione a caso contagioso Non infezione: i macrofagi alveolari (mφ) uccidono MTB 70% - 90% 10% - 30% Infezione: MTB prolifera nello spazio extracellulare e nei mφ Diffusione per via linfatica (ed eventualm. ematica) Risposta linfocitaria (produzione di IFN-γ attivante i mφ e di altre CK) responsabile di due fenomeni immunologici in genere coesistenti: - 1) una immunità cellulo-mediata( ICM ) capace di distruggere o ritardare la moltiplicazione e la diffusione dei micobatteri tubercolari. - 2) una ipersensibilità ritardata( IR ) al bacillo tubercolare e ai suoi prodotti capace di danneggiare i tessuti; tale ipersensibilità, si sviluppa in genere dopo 4-8 settimane dalla infezione, ed è responsabile della positività alle cutireazioni classiche per la diagnostica dell’ infezione tubercolare. proprio il bilanciamento di questi due sistemi comporta la successiva evoluzione verso la guarigione (prevalenza della ICM) oppure verso la formazione di estesi fenomeni istolesivi e colliquativi con quadri di tubercolosi cavitaria (prevalenza della IR) Fondamentale è l’immunità cellulo-mediata * Rischio maggiore negli immunodepressi (nel 95% dei casi infetti le cellule T controllano l’infezione, che rimane subclinica) (il 5% dei casi infetti va incontro a malattia attiva entro 1-2 anni) Infezione latente: MTB controllato dal sistema immunitario per tutto il resto della vita Malattia tubercolare: I soggetti sono sintomatici e possono trasmettere la malattia ad altri Riattivazione (5% di rischio durante il resto della vita) *

Mycobacterium tubercolosis INFEZIONE E RISPOSTA DEL SISTEMA IMMUNITARIO -1 La risposta immunitaria che si sviluppa nelle fasi iniziali dell’infezione tubercolare è una risposta prevalentemente di tipo cellulare. La componente umorale anticorpopoietica è invece apparentemente scarsa e comunque di difficile valutazione per quanto riguarda l’efficacia dei suoi effetti. La risposta cellulare nel soggetto infetto è responsabile: di una immunità cellulo-mediata( ICM ). Tale immunità cellulo-mediata è un meccanismo di resistenza all’infezione che si instaura e si osserva in ospiti che superino la prima infezione tubercolare: nelle successive infezioni essi hanno la capacità di distruggere o ritardare la moltiplicazione e diffusione dei micobatteri tubercolari. di una ipersensibilità ritardata( IR ) al bacillo tubercolare e ai suoi prodotti, la cosiddetta “allergia tubercolinica”. Tale ipersensibilità, che si sviluppa in genere dopo 4-8 settimane dalla infezione, può permanere nella memoria immunologica dell’ospite anche per tutta la vita, ed è responsabile della positività alle cutireazioni classiche per la diagnostica della malattia tubercolare. Il Mantoux test è una prova diagnostica che consiste nell'iniezione intradermica dell'avambraccio di una piccola quantità nota di tubercolina( più precisamente di 5 UI di derivati proteici purificati della tubercolina – PPD , Purified Protein Derivative) al fine di saggiare la reattività dell'individuo ad una eventuale infezione dal micobatterio della tubercolosi.

INFEZIONE E RISPOSTA DEL SISTEMA IMMUNITARIO -2 Entrambi i fenomeni immunologici, ICM e IR, sono legati alla attivazione dei linfociti T ed alla produzione delle loro citochine, che a loro volta chiamano in causa i macrofagi ed altri linfociti. I linfociti T non hanno solo una funzione effettrice capace di eliminare ad esempio cellule infette e organismi patogeni, ma hanno anche una funzione regolatrice tramite la produzione di linfochine, molecole che sono alla base di fenomeni di cooperazione cellulare nella risposta immunitaria. Le cellule a funzione effettrice possiedono la molecola di riconoscimento CD8 (sono dette CD8+) e sono i linfociti T citotossici; le cellule con funzione regolatrice sono marcate dalla CD4 (dette CD4+) e sono i linfociti T helper La ICM viene considerata come un fenomeno protettivo ed effettivamente benefico nella lotta all’infezione; è un processo immunitario idoneo a determinare il killing dei micobatteri e quindi la loro eliminazione. La IR accelera o amplifica la ICM, ed è quindi un fenomeno di fatto negativo e sovradimensionato rispetto alle effettive necessità di risposta dell’ospite; tutto il sistema immunocellulare funziona ad un ritmo per così dire esagerato rispetto all’entità del fenomeno infettivo, rendendosi responsabile di quei fenomeni caseosi e colliquativi che sono tipici delle lesioni istologiche tubercolari I due fenomeni sono in genere coesistenti, con prevalenza dell’uno o dell’altro, ma proprio il bilanciamento di questi due sistemi comporta la successiva evoluzione della malattia verso la guarigione (prevalenza della ICM) oppure verso la formazione di estesi fenomeni istolesivi e colliquativi con quadri drammatici di tubercolosi cavitaria (prevalenza della IR) Nell’evoluzione del quadro infettivo bisogna considerare l’influenza che ha sull’ospite la concentrazione loco-regionale degli antigeni micobatterici, nonché le caratteristiche di aggressività degli stessi bacilli. Una bassa concentrazione di bacilli, più facilmente, è in grado di modulare una risposta immunitaria cellulare attraverso meccanismi funzionalmente capaci di eliminare l’infezione tubercolare. Quando le concentrazioni batteriche sono elevate, vi è un rischio maggiore che si determini una notevole amplificazione della risposta immunitaria, senza che peraltro tale processo comporti una eliminazione dei bacilli stessi, ed il quadro evolva in senso patologico.

PATOGENESI E MANIFESTAZIONI CLINICHE -1 Le manifestazioni cliniche della Tubercolosi sono strettamente correlate al modo con cui si sviluppa la risposta immunitaria del paziente e più precisamente alla entità della risposta cellulare (IR e ICM) che come è noto modula l’entità dei fenomeni istolesivi della malattia. I quadri clinici sono estremamente diversi nei vari pazienti e particolarmente grave è la malattia tubercolare nei malati immunodepressi o con AIDS conclamato. Altri fattori di non secondaria importanza influenzano la clinica della tubercolosi, fra i quali: -l’età del paziente: i bambini fino a due anni sono molto suscettibili a forme miliari o meningee; -la nutrizione: l’indigenza e la malnutrizione riducono la resistenza alla malattia; -i fattori tossici: il fumo e l’alcool rappresentano fattori favorenti; -le patologie croniche : diabete, insufficienza renale; rappresentano fattori che incidono notevolmente sulla gravità della malattia. La trasmissione della malattia tubercolare avviene per contagio interumano in ambienti preferibilmente chiusi e sovraffollati e gli organi bersaglio sono rappresentati dall’apparato polmonare che incide per circa il 95% delle infezioni e da altri organi quali i reni, le ossa, la cute e i linfonodi, ma in via ipotetica qualunque distretto dell’organismo può essere colpito.

PATOGENESI E MANIFESTAZIONI CLINICHE -2 Quando in un individuo si verifica la prima da infezione da M. tubercolari, possono aversi due situazioni: - la malattia conclamata tubercolosi polmonare primaria; - una “infezione tubercolare latente” con lesioni silenti, che si manifesta molto più frequentemente rispetto alla malattia conclamata. Questi due processi hanno in comune la formazione di lesioni di tipo produttivo denominate tubercoli. Il tubercolo è un focolaio di infiammazione, con le caratteristiche della lesione granulomatosa cronica, costituito da un’area centrale formata da cellule epitelioidi, macrofagi e cellule giganti polinucleate contenenti bacilli tubercolari e da una zona periferica costi-

MDR (Multidrug resistance) : resistenza a Rifampicina e Isoniazide Responsabili della malattia tubercolare possono essere ceppi di MTC selvaggi e ceppi resistenti Tubercolosi farmacoresistente - primaria: resistenza ai farmaci anti-TBc in un paziente mai trattato per tubercolosi; - acquisita: resistenza ai farmaci anti-TBC in un paziente già trattato per tubercolosi Forme di resistenza: DR (drug resistance) : resistenza ad un farmaco di I° linea o a 2 non rientranti nella MDR MDR (Multidrug resistance) : resistenza a Rifampicina e Isoniazide XDR (Extensive drug resistance) : MDR + resistenza ai fluorchinoloni + ad almeno 1 degli iniettabili di II° linea(Amikacina, Kanamicina e Capreomicina)

Diagnostica micobatteriologica diretta Microscopia: colorazione di Ziehl-Neelsen, colorazione con auramina Coltura: su terreno solido su terreno liquido Amplificazione Diagnostica micobatteriologica indiretta ( per infezione tubercolare latente) Intradermoreazione di Mantoux Produzione in vitro di interferon-gamma Questi test, denominati con l'acronimo di IGRA (interferon gamma releasing assays), si basano sul principio che i linfociti T di individui sensibilizzati ( in vivo)con antigeni specifici, producono l'IFN-gamma quando vengono nuovamente in contatto ( in vitro) con gli stessi antigeni. Si presume, perciò, che un'elevata produzione in vitro di IFN-gamma possa essere indicativa di infezione tubercolare

Raccolta dei campioni respiratori La qualità del campione è determinante ai fini di una corretta diagnosi microbiologica * Raccomandazioni generali: utilizzare contenitori con tappo a vite, eseguire la raccolta nel modo più asettico possibile, prima dell’inizio della terapia antimicobatterica; inviare entro un’ora il campione al laboratorio ( se l’attesa si protrae oltre un'ora il campione deve essere conservato a 4°C) * Espettorato: 5-10 ml al mattino (per tre giorni consecutivi) * Prelievi broncoscopici: > 3 ml

Colorazione di Ziehl-Neelsen L’esame microscopico in micobatteriologia è il test più rapido ed economico. Sfrutta una caratteristica che solo i micobatteri possiedono in maniera accentuata: l’alcool acido resistenza La colorazione di Ziehl-Neelsen è la più classica fra le metodiche di colorazione dei micobatteri. Il colorante principale è la fucsina fenicata che viene versata in modo da coprire tutta la superficie del vetrino. Questo viene poi riscaldato su becco Bunsen fino alla produzione di una leggera nuvola di vapore. Si attendono 5 minuti e quindi il preparato viene lavato e decolorato per 2 minuti con soluzione acido-alcoolica. Si contrasta infine con blu di metilene per 1 minuto.

L’esame colturale I materiali opportunamente pretrattati sono inoculati nel terreno solido e in terreno liquido. L'osservazione delle colture viene eseguita settimanalmente e la risposta di positività è data non appena si riscontra la crescita di colonie. La risposta negativa all'esame colturale è data dopo 60 giorni di incubazione( per i terreni solidi) I campioni respiratori( espettorati, broncolavaggi) normalmente sono contaminati da flora residente nelle prime vie aeree I Micobatteri hanno una crescita lenta che verrebbe nascosta o impedita dallo sviluppo degli altri batteri …ma i Micobatteri hanno una spiccata resistenza agli alcali, e questa loro proprietà viene sfruttata nel trattamento decontaminante Se la percentuale delle colture contaminate è <3% la decontaminazione è troppo energica e rischia di danneggiare eccessivamente i Micobatteri; se invece è >5% la decontaminazione è troppo debole o la fluidificazione è incompleta

Identificazione È indispensabile giungere all’identificazione di tutti i micobatteri cresciuti in coltura, poiché tale informazione è cruciale per diagnosi e terapia. I laboratori che non eseguono l’identificazione devono inviare gli isolati ad un centro di riferimento Una identificazione a livello di raggruppamento di specie è accettabile per alcuni micobatteri ( esempi: micobatteri facenti parte del Mycobacterium tuberculosis complex; micobatteri del Mycobacterium avium complex). Di fondamentale importanza dal punto di vista clinico e terapeutico è la differenziazione, che deve essere effettuata nel più breve tempo possibile, tra micobatteri appartenenti al Mycobacterium tuberculosis complex e micobatteri non tubercolari (MNT). Per l’ identificazione si utilizzano diverse tecniche : -test biochimico-colturali ( ormai quasi completamente abbandonati); tecniche cromatografiche ( verso i lipidi della parete dei micobatteri); DNA-probe (sonde costituite da DNA aventi sequenza specie-specifica)

La coltura ( anche con i terreni liquidi che pure consentono un rilevamento più sensibile e precoce della crescita rispetto ai terreni solidi) e le successive identificazioni necessitano comunque di tempi lunghi Amplificazione HIV positivi e pazienti immunocompromessi: frequenti infezioni anche da MOTT, e in particolare MAC. Necessità di una diagnosi microbiologica rapida per la tubercolosi, anche perché molti dei micobatteri non tubercolari sono generalmente resistenti ai farmaci di prima scelta utilizzati per la tubercolosi. disponibili diverse tecniche di amplificazione: in poche ore vengono prodotte “in vitro” milioni di sequenze nucleotidiche specie specifiche del M. tubercolare direttamente dal campione biologico; tra le tecniche più conosciute e diffuse: - Polymerase Chain Reaction (PCR) - Transcription Mediated Amplification (TMA) (Performance: elevate sensibilità e specificità , ma test di riferimento rimane l’esame colturale)

Test di sensibilità L’antibiogramma deve essere eseguito su tutti i ceppi di M.tuberculosis in occasione del primo isolamento. I farmaci antitubercolari testati di prima scelta sono: Isoniazide, Rifampicina, Etambutolo, Streptomicina, Pirazinamide In caso di fallimento terapeutico, dovuto a resistenze primarie o a resistenze secondarie, dovrebbero essere saggiati anche: PAS, Etionamide, Kanamicina, Amikacina, D-Cicloserina, Ciprofloxacina, Ofloxacina

Metodo delle proporzioni Tra le metodiche di laboratorio per saggiare la sensibilità ai farmaci antitubercolari, il metodo delle proporzioni è considerato come test di riferimento Se in una popolazione micobatterica è presente più dell’1% di mutanti resistenti ad un farmaco, tale popolazione è da considerare resistente, in quanto la percentuale suddetta è destinata ad aumentare rapidamente per effetto della pressione selettiva esercitata da una terapia che utilizzi tale farmaco PAS Etamb. Ison. Strept. Rifam. Contr. Mod. da groupe azay

In Italia Secondo i dati riportati in “ La tubercolosi in Italia – anno 2008 ” , in occasione della Giornata mondiale per la tubercolosi (24 marzo 2010), in Italia nel 2008 la percentuale di tubercolosi multiresistente (Mdr-Tb) nel 2008 è lievemente aumentata rispetto al 2007, attestandosi al 3,7% del totale dei ceppi analizzati. Tra i nuovi casi di Tb, la percentuale di ceppi Mdr è il 2,7% e dal 2004 è in lieve e costante aumento