Risultati sperimentali recenti mostrano che un tumore può impiegare anche decenni per svilupparsi e raggiungere gli stadi più aggressivi (Vogelstein et al., 2013). All’interno del tumore convivono cellule tumorali, staminali del cancro (CSC), cellule del sistema immunitario, del sistema vascolare e fibroblasti. La loro interazione crea un particolare microambiente che contribuisce allo sviluppo del tumore

L’interazione tra le cellule tumorali e l’ambiente è reciproca. Le cellule neoplastiche interagiscono con esso e lo modificano attivamente, ad esempio: rimodellandolo e creando delle nicchie specializzate in cui le condizioni sono ideali per sostenere la propria crescita; o ancora, reclutando e corrompendo le cellule “sane” circostanti, perché le aiutino ad attuare i propri programmi (Hanahan and Coussens, Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment 2012).

Fenotipo angiogenetico Acquisizione delle cellule neoplastiche di un proprio letto vascolare

dare metastasi senza sviluppare una nuova vascolarizzazione Un tumore non può diventare più grande di 1-2mm (alcuni millioni di cellule) e dare metastasi senza sviluppare una nuova vascolarizzazione Una volta avvenuta la neovascolarizzazione la crescita tumorale è rapida e si può verificare (ma non necessariamente) il fenomeno della metastatizzazione Il passaggio "switch"al fenotipo angiogenetico richiede la ‘up-regulation’ di fattori angiogenetici e la contemporanea ‘down-regulation’ di inibitori dell’angiogenesi L'endotelio dei vasi in immediata vicinanza del tumore viene attivato da fattori di crescita da parte delle cellule stromali del tumore.

Dormienza Il tumore dormiente è una massa tumorale microscopica, clinicamente non evidenziabile. Non si ha l’espansione della massa tumorale. La dormienza è caratteristica e del tumore primario e delle metastasi. Blocco G° Immunosorveglianza Ormoni Secondo Folkman la dormienza può essere dovuta alla presenza di fattori inibitori e all’incapacità della cellula di produrre fattori angiogenici. Nel tumore dormiente l’indice proliferativo è paragonabile a quello del tumore in crescira, invece è aumentata l’apoptosi. Fenotipo angiogenicoDiminuzione dell’apopptosi

Ruolo dello stroma Le cellule tumorali possono alterare lo stroma a formare un ambiente permissivo alla crescita neoplastica o la possono contrastare Invasione Angiogenesi Metastasi Infiammazione

Angiogeneticità delle cellule tumorali Livelli di glucosio Citochine Fattori di crescita O2 Vascolarizzazione dei tumori Gli oncogeni sono coinvolti nell’angiogenesi: 1-possono codificare per i fattori angiogenetici 2-i loro prodotti regolano la sintesi dei fattori stessi 3-regolano la sintesi di enzimi proteolitici necessari per l’angiogenesi Gli oncosoppressori controllano soprattutto la produzione degli inibitori

Fattori angiogenetici Ipossia SAPK (stress activated protein kinase) HIP (hypoxia induced transcription factor) VEGF (vaso-endothelial growth factor) Attiva i geni che codificano per MMP e integrine Induce le cell endoteliali a proliferare

Inibitori fisiologici L’induzione dell’angiogenesi non è una condizione sufficiente alla progressione tumorale, se questa è bilanciata dalla produzione di inibitori Molte cellule normali producono inibitori dell’angiogenesi, al contrario in molti tumori si è osservata una ridotta produzione Gli inibitori dell’angiogenesi possono agire a diversi livelli: bloccando la produzione dei fattori angiogenetici(IFN), il loro legame ai recettori suule cellule endoteliali agendo direttamente sulle cellule endoteliali

• Angiostatina (plasminogeno) • Endostatina (collagene) L’angiogenesi è mediata da numerose molecole rilasciate sia dalle cellule tumorali sia da altre cellule, quali: cellule endoteliali,epiteliali, mesoteliali e leucociti Fattori angiogenetici: b-FGF VEGF Angiogenina Angiopoietina IL-8 EGF Fibrina Nicotinamide PD-ECGF PDGF TGF TNF NO Inibitori dell’angiogenesi: • Angiostatina (plasminogeno) • Endostatina (collagene) • Vasculostatina (tranretina) • Frammento di fibronectina • Frammento di prolattina • IFN e β • Trombospondina • Inibitori degli enzimi proteolitici • Inibitori tissutali delle metalloproteasi p53 ras, myc

L’angiogenesi del tumore è diversa da quella fisiologica 1-Le cellule endoteliali normalmente quescienti sono risvegliate dai vari fattori angiogenici attraverso l’attivazione dei recettori tirosin-chinasici specifici 2- alla degradazione proteolitica della membrana basale segue la migrazione delle cellule endoteliali nella matrice interstiziale e la loro proliferazione 3-infine le cellule si organizzano a formare strutture tubulari, si ha la maturazione funzionale dell’endotelio e il passaggio del flusso sanguigno L’angiogenesi del tumore è diversa da quella fisiologica

L’ipossia costituisce un’importante stimolo per la sua espressione. VEGF Il fattore di crescita degli endoteli vascolari (VEGF) sembra avere un ruolo determinante nella neovascolarizzazione tumorale. E’un mitogeno specifico delle cellule endoteliali che esercita le sue funzioni tramite recettori specifici VEGFR-1 e VEGFR-2. L’ipossia costituisce un’importante stimolo per la sua espressione.   VEGF ed i suoi recettori sono sovra espressi nella maggior parte dei tumori. Bloccando VEGFR-2 con un anticorpo si inibisce l’angiogenesi tumorale e si converte un fenotipo tumorale maligno in uno benigno. Avastin

ANGIOSTATINA E’stata isolata dalle urine di ratti con tumori polmonari. Strutturalmente e una proteina di 38-kD che rappresenta un frammento della catena del plasminogeno che contiene i primi 4 ponti disulfurici del plasminogeno Non si pensa che le cellule tumorali producano l’angiostatina, ma che siano in grado di produrre o attivare proteasi capaci di generare l’angiostatina dal plasminogeno circolante. L’angiostatina è un’inibitore specifico della proliferazione e migrazione delle cellule endoteliali. L’inibizione della vascolarizzazione nel tumore produce un aumento dell’apoptosi cellulare.  

Trattamenti ripetuti non sembrano indurre resistenza. ENDOSTATINA L’endostatina è il frammento C-terminale di 20 kd del collagene di tipo XVIII, una molecola di collagene recentemente scoperta che è presente soprattutto in prossimità dei vasi. Anche l’endostatina è un inibitore specifico della proliferazione delle cellule endoteliali ed un potente inibitore dell’angiogenesi.   Anche in questo caso vi è induzione di apoptosi nelle cellule tumorali. La combinazione di endostatina ed angiostatina produce una azione sinergica che si traduce in una completa regressione tumorale in modelli sperimentali ed assenza di ricrescita dopo l’interruzione del trattamento. Trattamenti ripetuti non sembrano indurre resistenza.

Interazione tumore primario metastasi 1- IL tumore primario inibisce l’angiogenesi nella sede metastatica. L e metastasi compaiono alcuni mesi dopo la rimozione del tumore. 2-Il tumore primario non sopprime l’angiogenesi delle metastasi, queste sono evidenziabili già al momento della diagnosi del primario. 3-Le metastasi vengono diagnosticate ma il tumore primario resta occulto. E’ possibile che in questi casi la velocità di crescita delle metastasi è tale da raggiungere una massa critica per cui riesce a rilasciare in circolo abbastanza inibitori da controllare il tumore primario. 4- Le metastasi possono acquisire il fenotipo angiogenico a distanza di anni dall’impianto, per cui compaiono anche dopo alcuni anni dall’asportazione del primario. Es. Ca mammella. 5-Le metastasi presenti al momento della diagnosi regrediscono dopo l’asportazione del tumore primario. E’ probabile che in questo caso le metastasi dipendono dal tumore primario per fattori di crescita/angiogenesi. Interazione tumore primario metastasi

Fenotipo invasivo

Circa il 90% di tutte le patologie tumorali con decorso mortale sono causate da metastasi Circa 1x106 cell neoplastiche possono raggiungere il flusso sanguigno 85% CTC muore entro 5 minuti Solo 0.01% delle cellule neoplastiche circolanti metastatizza

Profilo genetico simile tra metastasi e tumore primitivo Tumori possono rilasciare cellule in circolo ai primi step della cancerogenesi Profilo genetico simile tra metastasi e tumore primitivo Altri tumori sono invasivi ma raramente metastatizzano o Metastatizzano dopo aver accumulato una serie di mutazioni

Importanza del microambiente Organismo intorno al tumore Tumore

Le cellule tumorali possono alterare lo stroma adiacente per formare un microambiente idoneo alla progressione del tumore Le cellule neoplastiche producono fattori di crescita e proteasi che modificano lo stroma Le cell. neoplastiche producono fattori di crescita e proteasi che modificano lo stroma

Invasività e Metastasi 1mm 106

La neoplasia si può considerare un tessuto costituito da: Le cellule del tumore che possono cambiare drasticamente rispetto al loro: stato differenziativo velocità di proliferazione organizzazione rispetto al tessuto normale. Le cellule dello stroma nel tessuto neoplastico regolano la progressione e la metastasi Dialogo tra le cellule tumorali e normali sostenuto da loop autocrini e paracrini

può essere considerato una malattia dell’architettura dei tessuti, Il cancro può essere considerato una malattia dell’architettura dei tessuti, progredisce verso una serie di fenomeni con disturbi dei rapporti intercellulari

Invasività Abilità di superare le membrana basale e di spostarsi attraverso la matrice extracellulare è causata dalla concomitanza di tre fenomeni distinti: 1.diminuzione dell’adesione cellula-cellula normalmente mantenuta da particolari proteine (ad es. la E-caderina) 2. alterazione dei meccanismi di adesione con la matrice (integrine) 3. attivazione della sintesi di enzimi proteolitici metalloproteasi (collagenasi), serino-proteasi, cisteino-proteasi 4. capacità di rispondere a proteine ad attività chemiotattica

Meccanismi di adesione cellulare

MEC epiteliociti c. connettivali c. neoplastica

Molecole di adesione cellulare CAM=Cell-Cell Adhesion Molecules Glicoproteine transmembranacee mediano la formazione di legami e la trasmissione di segnali Caderine, integrine, selectine, IgCAM e rCD44 Adesività omotipica Riconoscimento e interazione tra cellule dello stesso tipo Adesività eterotipica Riconoscimento e interazione tra cellule di tipo diverso o tra cellule e ECM

Qualitativi Quantitativi

Modificazioni dell'adesività omotipica Riduzione o perdita dell'adesività omotipica

Ca stomaco e prostata (caderine ) Caderina Cellula omologa Trasduzione del segnale Ca stomaco e prostata (caderine ) Ca tiroide (catenine)

Integrano segnali intra ed extra-cellulari Adesività eterotipica Le integrine Sono glicoproteine transmembrana eterodimerichemolecole formate da una subunità α e una β, Ca e Mg dipendenti Integrano segnali intra ed extra-cellulari Dominio extra-cellulare lega la MEC Dominio intra-cellulare complesso focale di adesione

qualitativamente e quantitativamente Nelle cellule tumorali l’espressione delle integrine si presenta modificata qualitativamente e quantitativamente

Le integrine si organizzano in gruppi e legano il citoscheletro Migrazione

Le cellule muoiono dopo aver svolto la loro azione Movimento senza finalità Sopravvivenza

αvβ3 αvβ5 Potere metastatogeno Farmaci anti-neoplastici rivolti ad inibire l’effetto delle itegrine Peptidi RGD. Portano il dominio Arg-Gly-Asp legano ed inibiscono α

Selectine L-selectina espressa sui leucociti E- espressa sull’endotelio dopo attivazione P- piastrine ed endotelioattivato contenuta nei granuli di Weibel e Palade Selectine

Correlazione tra alta espressione di ligandi per le selectine e malignità Interazione tra cellula neoplastica con piastrine e leucociti risulta nella formazione di emboli Interazione tra cellula neoplastica ed endotelio porte alla extrvasazione Interazione selectina-selectina rilascia segnali che determinano quando e dove si arresta la metastasi

CD44 Famiglia di recettori costituita da glicoproteine di membrana Lega: ACIDO IALURONICO fibronectina, osteopontina e collagene selectine

Locomozione delle cellule neoplastiche Il citoscheletro è costituito da: Proteine contrattili: actina, tropomiosina, troponina, miosina, paramiosina, tubulina, anchirina, vinculina Proteine strutturali transmambranacee Sistema di controllo

Perdita dell'inibizione da contatto

Le cellule tumorali secernono degli enzimi che digeriscono il tessuto connettivo circostante, favorendo l’invasione negli altri organi

Le cellule del nostro organismo sono circondate da collagene e tessuti connettivi. Per crescere ed espandersi, le cellule sane devono decomporre la barriera esterna che le circonda. Le cellule producono e secernono diversi enzimi che digeriscono le molecole dei tessuti connettivi, prevalentemente costituiti da collagene ed elastina. Per impedire la distruzione incontrollata dei tessuti, è importante che questi enzimi, collagenasi, siano regolati da una serie di inibitori naturali. La crescita tumorale è accompagnata da una decomposizione eccessiva dei tessuti connettivi.

Derepressione di geni che codificano per enzimi proteolitici: 1)Serinproteasi 2)Cisteinproteasi 3)Metalloproteasi (collagenasi, gelatinasi, elastasi, ecc) Attivatore del plasminogeno Marker tumorale TIMp: inattivano MMP

L’eccessiva produzione di enzimi collagenasi da parte delle cellule tumorali favorisce la loro diffusione in altri organi.

Le metastasi Le metastasi rappresentano un autotrapianto delle cellule neoplastiche che si distaccano dal tumore primario con diversi meccanismi raggiungono i diversi siti vi si impiantano e possono dar luogo alla crescita di tumori secondari

e di dare metastasi a distanza. Competenza metastatica Le due proprietà esclusive delle cellule tumorali maligne sono la capacità di invadere localmente e di dare metastasi a distanza. Sono questi gli aspetti responsabili della maggior parte dei decessi per cancro.

• La capacità di formare metastasi non è una proprietà di tutte le cellule neoplastiche. • La metastatizzazione si inizia in conseguenza della capacità intrinseca di un determinato gruppo di cellule tumorali ed è conseguenza di una insufficiente reazione da parte dell'organismo ospite. • Le cellule nell'ambito di un tumore, anche se monoclonale, differiscono tra loro nella capacità di formare metastasi e variazioni sono state anche osservate nel tempo (eterogeneità tumorale) • L'eterogeneità tumorale è dovuta molto probabilmente alla inerente instabilità genetica del tumore • Ciò implica che le cellule di un clone non necessariamente ereditano e mantengono inalterata tale proprietà • Molte alterazioni biochimiche sembrano coinvolte nella progressione di un tumore da un clone omogeneo ad un gruppo di sottopopolazioni cellulari eterogenee alcune delle quali posseggono tutte le proteine di membrana e gli enzimi necessari alla formazione di metastasi • E'probabilmente per questo motivo che la frequenza di metastasi è bassa durante lo sviluppo iniziale del tumore.

Tappe della cascata metastatica 1. Distruzione della membrana basale 2. Distacco cellulare 3. Motilità cellulare 4. Invasione del tessuto connettivo 5. Penetrazione del sistema vascolare o linfatico 6. Cellule cancerose circolanti 7. Arresto (nei vasi) Attraversamento dei vasi e proliferazione

Metastasi è un processo inefficiente In modelli sperimentali, l’inezione di milioni di cellule cancerose provoca un numero irrisorio di nuovi tumori 1.Quali sono le tappe di questo processo? 2.Quali le tappe efficaci ed inefficaci? 3.Come possono alcuni di queste tappe, essere bloccate terapeuticamente? Es:selezione di cloni ad alta competenza metastatica Topo, melanoma B16

Inefficienza metastatica Le cellule neoplastiche che viaggiano nel circolo sanguigno vanno incontro ad una serie di eventi Favoreli Sfavorevoli Irrilevanti 1.Cellule Killer 2.Legame con Ab 3.Uccisione mediata dal Complemento 4.Uccisione da altri citotipi 5.Adesione delle piastrine 6.Passsaggio attraverso il cuore 7.Compressione e distruzione attraverso i capillari polmonari 8.Arresto nei capillari alveolari 9.Esposizione a conc tossiche di O2 10.Ritorno nella circ sistemica 11.Compressione e distruzione nei capillari periferici 12.Marginazione nei vasi della microcircolazione 13.Arresto e crescita 14.Ritorno al cuore Circa 1 minuto

Modalità di diffusione metastatica La distribuzione delle metastasi dipende da diversi fattori: Sito e tipo di tumore Rete ematica e linfatica regionale Rapporto tra metastasi e tessuto ospite L’organo in cui si sviluppa la metastasi può essere raggiunto attraverso: la via ematica (sarcomi) la via linfatica ( carcinomi metastatizzanti) la via trancelomatica la via canalicolare contiguità

Metastasi per via ematica Microtrombo aderisce alla parete del vaso e penetra nel sangue Embolo neoplastico: Cellula tumorale avvolta da un reticolo di fibrina , da piastrine e altre cellule ematiche Disseminazione per via ematica: Sarcomi Alcuni ca (rene, prostata, tiroide e fegato) corionepitelioma Il cammino neoplastico ha una durata variabile e si conclude in genere a livello delle venule precapillari o capillari

Carcinoma della prostata  osso Ciascun tipo di cancro ha la tendenza a metastatizzare organi specifici: Carcinoma della prostata  osso Cancro polmonare a piccole cellule  Cervello Neuroblastoma  fegato Mammella  polmoni, ossa, fegato Carcinoma renale a cellule chiare  tiroide Melanoma oculare  fegato. Rene, milza, muscolo scheletrico e cuore sono raramente sede di metastasi

Fattori meccanici possono arrestare il cluster di cellule tumorali Pattern circolatorio (James Ewing 1920) L’accesso meccanico del processo invasivo appare determinante. Ipotesi seme-terra (Stephen Paget 1889): le cellule cancerose, hanno analogie con i semi che crescono meglio su suoli ospitali. Fattori meccanici possono arrestare il cluster di cellule tumorali nei capillari prossimi al tumore primario ma il microambiente: fattori di crescita, chemochine, fattori angiogenici ne può influenzare la sopravvivenza e la formazione delle metastasi

Pattern circolatorio La localizzazione delle metastasi è in rapporto all’irrorazione dell’organo e l’arresto dipende dalla circolazione venosa che drena la neoplasia

Sedi metastatiche prevalenti Tumori del colon: al fegato tramite linfatici mesenterici e il sistema venoso portale dal fegato al polmone tramite la cava inferiore, il ventricolo destro e l’arteria polmonare Tumori della mammella: ai polmoni tramite il sistema linfatico e la vena cava superiore, o allo scheletro tramite il sistema del plesso di Batson delle vene paravertebrali Tumori del polmone: al cervello, fegato, ossa e altro, tramite vena polmonare e ventricolo sinistro ha accesso al circolo arterioso

Semplici considerazioni emodinamiche non sono però sufficienti a spiegare il pattern metastatico di parecchi tumori umani, ad es. metastasi cerebrali da carcinoma della mammella o da melanoma.

Ipotesi “seed and soil” della organo-specificità delle metastasi (Stephen Paget 1855-1926) La cellula attecchisce e si sviluppa dove può estrinsecare le proprie caratteristiche Il microambiente dell’organo target può influenzare la sopravvivenza di cellule cancerose metastatizzanti Fattori di crescita rilasciati dagli organi secondari possono stimolare o inibire molti aspetti funzionali cellulari: quali la sopravvivenza e la proliferazione e l’angiogenesi ecc mammella fegato milza

Interazioni con il microambiente Arresto – Adesione a molecole endoteliali organo-specifiche o inducibili (es. Vascular Cell Adehsion Molecule, VCAM, controreccettore dell’integrina 41) Invasività – Fattori inducenti prevalgono su quelli inibenti (attivazione delle MMP) Crescita/morte cellulare – Fattori di crescita organo-specifici Reattività immunitaria – Difese immunitarie organo-specifiche, macrofagi, ecc. Resistenza alla terapia – Diversa espressione di farmaco­resistenza (es. MDR1) a seconda del sito metastatico

Chemochine e loro recettori determinano il destino metastatico della cellula neoplastica Alcune cellule di cancro mammario esprimono recettori chemiochinici quali CXCR4 e CCR7 I ligandi per questi recettori, CXCL12 e CCL21, sono espressi con livelli significativi nel polmone, nel fegato, ma non in altri tessuti Cellule di carcinoma mammario trasportate ai polmoni potrebbero, quindi, trovare un ambiente altamente ospitale.

Il numero di programmi molecolari per il processo di metastasi è estremamente elevato. L’interazione tumore-organo può essere diversa Ca mammalla e prostata danno metastasi ossee Ca mammella colonizza osteoclasti Ca prostata colonizza osteoblasti

Metastasi per via linfatica I tumori epiteliali metastatizzano molto frequentemente per via linfatica Il contatto avviene a livello del connettivo stromale La parete dei capillari è privo di membrana basale Le cellule tumorali, sotto forma di emboli, sono trasportate ai linfonodi locoregionali

Modelli della cascata metastatica Le cellule neoplastiche possono metastatizzare dal tumore primario attraverso la via linfatica Le cellule neoplastiche metastatizzano direttamente per via ematica

Metastasi linfonodali Invasione dei linfonodi come fattore prognostico Ingrossamento dei linfonodi non vuol dire sempre che sono invasi, a volte sono reattivi. Linfonodo sentinella: identificare il primo linfonodo che riceve linfa dal tumore Buona correlazione tra positività del linfonodo sentinella (presenza di cellule tumorali) e metastatizzazione a distanza.

Destino delle cellule neoplastiche una volta raggiunto il linfonodo: Possono proliferare e sostituire le cellule linfoidi locali originando metastasi secondarie Muiono per azione del cellule dell’immunità o per carenze metaboliche Sopravvivono in una condizione di dormienza

Significato prognostico dell'interessamento linfonodale Tumori testa-collo Linfonodo positivo correla con il 50% di rischio di sviluppare metastasi a distanza, contro il 7% di possibilità nei tumori linfonodi negativi Mammella 20-30% di pazienti con linfonodo negativo sviluppano metastasi a distanza Tumori della mammella possono by-passare le stazioni linfonodali

Pleura Peritoneo Pericardio (raro) Via trancelomatica La disseminazione metastatica ha luogo nelle cavità sierose Pleura Peritoneo Pericardio (raro) Le cellule neoplastiche aderiscono alla superficie della sierosa, liberano l’attivatore del plasminogeno plasmina fibrinogeno fibrina Avvolge C neoplastiche Polmone Esofago Mammella Pleura Pericardio Stomaco Intestino Peritoneo

Le cellule tumorali percorrono il dotto escretore della ghiandola Via canalicolare Le cellule tumorali percorrono il dotto escretore della ghiandola Organo

Metastasi per contiguità Labbro opposto a quello dove si è sviluppato il tumore primitivo

Geni e metastasi P53, Ras e Myc Her/ Neu rec EGF CD44 (molecola di adesione) Caderine/Catenine mRNA SNAIL e TWIST transizione epitelio-mesenchima

Esistono sottotipi di tumori della mammella identificati per mezzo dei loro profili molecolari con diverso decorso della malattia L’analisi della leucemia linfoblastica acuta mediante microarray a DNA ha consentito di individuare i profili molecolari di sottotipi con prognosi diverse e di scoprire nuovi marcatori associati a questi sottotipi

Spot con elevata fluorescenza rossa Aumentata espressione di un gene nel tumore Spot verde Diminuita espressione del gene nel tumore Spot neri o gialli Nessuna differenza