Molecole biologiche contenenti azoto: Proteine (amminoacidi, 50% DW) Numero di ossidazione Composto + 5 Acido nitrico HNO3/anidride nitrica N2O5 + 4 Ipoazotite NO2 (diossido d’azoto) + 3 Acido nitroso HNO2/anidride nitrosa N2O3 + 2 Monossido d’azoto NO + 1 Protossido d’azoto N2O (ossido di diazoto) Azoto N2 - 1 Idrossilammina NH2OH - 2 Idrazina NH2NH2 - 3 Ammoniaca NH3 Ciclo dell’ Azoto Molecole biologiche contenenti azoto: Proteine (amminoacidi, 50% DW) Acidi nucleici (basi azotate, 20% DW) Cofattori Vitamine Metaboliti secondari Ambiente Caratteristiche dell’azoto Organismi Funzioni nel ciclo Rocce Indisponibile (eruzioni vulcaniche) Atmosfera 78% di N2, disponibile per la fissazione Oceani Azoto disciolto (varie forme) Microrganismi Fissano l’azoto, producono sostanze azotate Suolo Nitriti, nitrati, ammoniaca, composti organici, humus (riserva) Fissano l’azoto, producono e trasformano sostanze azotate Superficie Azoto organico Piante Animali Producono sostanze azotate

NAD B12 CoA FAD TPP

Ciclo dell’azoto: passaggi principali fatti principalmente dai microrganismi N2 azoto atmosferico Fissazione e immobilizzazione: anche passaggio unico N2 NH3/NH4+ Azoto organico (R-NH2) NO2-/NO3- Fissazione Nitrificazione (ossidazione) Denitrificazione (riduzione) NO, N2O Ammonizzazione (mineralizzazione) Assimilazione (immobilizzazione) Riduzione

Distribuzione sostanze azotate ambiente +5 +4 +3 +2/+1 R-NH2 NH3/NH4+ miscellanea Atmosfera HNO3 NO2 NO/N2O N2 NH3 Suolo HNO2 Sostanza organica Piante Animali Microrganismi Acqua NH4+ Sedimenti Attività umana Combustibili Fertilizzanti Alimenti Fibre Legno Rifiuti Quantità di azoto nei serbatoi: rocce e sedimenti > > atmosfera > > oceani > > suoli > piante > > animali > = ordine di grandezza

Ammonizzazione (mineralizzazione): R-NH2 → NH4+ Azoto organico (R-NH2) NO2-/NO3- Ammonizzazione (mineralizzazione): R-NH2 → NH4+ Azoto organico: residui di piante, animali, microrganismi (proteine, acidi nucleici, urea, humus) Monomeri liberi Proteasi Peptidasi Ureasi … (esoenzimi) Assimilazione cellulare Metabolismo ammonio composti C (biomassa) microrganismi Microrganismi procarioti ed eucarioti, aerobici e anaerobici L’azoto è spesso un componente ‘limitante’ e quindi viene preferenzialmente assimilato e non mineralizzato A pH neutro prevale l’ammonio, solubile e disponibile A pH alcalino prevale l’ammoniaca che volatilizza con impoverimento di azoto

(glutamina oxoglutarato ammino trasferasi) NH3/NH4+ Azoto organico (R-NH2) NO2-/NO3- Assimilazione (immobilizzazione): NH4+ → R-NH2 Microrganismi: batteri, archea ed eucarioti Principali reazioni di assimilazione: Glutammato sintasi + glutammina sintasi (GOGAT + GS): elevata affinità (veloce), consuma ATP Glutammato deidrogenasi (GDH): più lenta ma non consuma ATP Chetoglutarato + glutammina Glutammato + glutammato GOGAT (glutamina oxoglutarato ammino trasferasi) GS + ATP + NH4+ Chetoglutarato + NH4+ Glutammato + H2O GDH + NADPH/H+

assimilazione Ammonio/ammoniaca R-NH2 ammonizzazione Equilibrio dipende da: Concentrazione substrati Ossigeno Temperatura pH

NH3 + 2 O2 → HNO3 + H2O (reazioni 1+2) NH3/NH4+ Azoto organico (R-NH2) NO2-/NO3- Nitrificazione NH3 → HNO3 2 passaggi → due tipi di batteri: aerobi, chemiolitotrofi (energia da composti inorganici), autotrofi (CO2) NH3 HNO2 HNO3 e-, ATP Nitricanti (nitrito ossidanti) Nitrosanti (ammonio ossidanti) NH3 + 3/2 O2 → HNO2 + H2O HNO2 + ½ O2 → HNO3 NH3 + 2 O2 → HNO3 + H2O (reazioni 1+2)

Nitrospira Nitrobacter Nitrococcus Nitrosomonas Tipo Genere Specie Ambiente Nitrosanti Nitrospira tenuis, multiformis Suolo, acque dolci Nitrosomonas marina Marino ureae Acque dolci oligotrofiche, suolo europea Acque reflue, dolci, eutrofiche, salmastre Nitrosococcus oceani Nitricanti Nitrococcus mobilis Nitrospina gracilis moscoviensis Acque dolci Nitrobacter winogradskyi Acque dolci, suolo, rocce hamburgensis vulgaris

Batteri nitrosanti – enzimi tipici: Ammoniaca mono-ossigenasi (AMO): enzima (idrossilante) ad ampio spettro attivo anche su cloroformio, tricloroetilene, cloroetani etc (impiego in biorisanamento di acque e suoli dei batteri) Idrossilammina ossidoreduttasi (HAO) NH3 + O2 + 2e- + 2H+ AMO NH2OH + H2O (citoplasma) UbH2 Ub Cit cb (periplasma) HNO2 + 4H+ + 4e- HAO 2H+ + 2e- 1/2O2 + 2e- +2H+ H2O ossidasi Cit c ADP + Pi ATP 2H+ Produzione di protoni Consumo di protoni Ubichinone

Enzimi: Nitrito ossidoreduttasi (NOR) Batteri nitricanti: Enzimi: Nitrito ossidoreduttasi (NOR) HNO2 + H2O NOR HNO3 + 2e- + 2H+ 1/2O2 + 2e- +2H+ H2O ossidasi ADP + Pi ATP 2H+ Cit c (citoplasma) (periplasma) Produzione di protoni Consumo di protoni

Batteri nitrificanti (nitrosanti e nitricanti) – caratteristiche generali: Ubiquitari del suolo e delle acque Aerobi obbligati Mesofili: pH ottimale 7-8 Autotrofi: usano CO2 (Ciclo di Calvin) come fonte C Resa energetica dell’ossidazione dell’ammoniaca è bassa: solo il 10% Resa in biomassa dall’ossidazione dell’azoto: 15-70 moli N/moli C (nitrosanti) 75-135 moli N/moli C (nitricanti) Luce: influenza negativamente l’ossidazione dei composti azotati Importanza ecologica: l’ammonio (carica +) si lega al terreno e viene trattenuto. I nitriti e nitrati (carica -) non si legano, vengono dilavati e si accumulano nelle acque Nitrificazione da funghi (eterotrofi): quantitativamente marginale

Denitrificazione – tre fenomeni: Denitrificazione HNO3 → N2O → N2 NH3/NH4+ Azoto organico (R-NH2) NO2-/NO3- Denitrificazione – tre fenomeni: Denitrificazione HNO3 → N2O → N2 Riduzione HNO3 → NH4+ Assimilazione HNO3 → NH4+ → R-NH2 Riduzione dissimilativa/respirazione del nitrato Riduzione assimilativa del nitrato Assimilazione Trasformazione del nitrato in azoto organico (amminoacidi, basi azotate etc) Metabolismo sia aerobico che anaerobico Microrganismi in grado di crescere su nitrato come fonte N Richiede energia Microganismi: Klebsiella, Rhodobacter, cianobatteri HNO3 NH3 R-NH2 biomassa riduzione biosintesi crescita repressione L’ammoniaca (ammonio) non si accumula Se esogena, non si ha la riduzione del nitrato

Il primo passo è il trasporto del substrato: tre meccanismi possibili Il nitrato (solo quello che serve) viene quindi ridotto ad ammonio e l’ammonio assimilato nelle vie biosintetiche NO3- NO2- antiporto H+ simporto ABC transporter ATP ADP + Pi NO3- NO2- NH2OH NH4+ glutammato Nitrato reduttasi (NAS) NADH o ferredoxina dipendenti Nitrito reduttasi (NAS) Idrossilammina reduttasi (HCP) Glutammato o glutammina sintasi

Riduzione dissimilativa DENITRIFICAZIONE (riduzione dissimilativa o respirazione del nitrato) Nitrato = non – ovvero non solo - fonte N Due vie: Riduzione ad azoto (A) Riduzione ad ammonio (B) Il nitrato è trasportato per simporto protonico (trasportatore NAR/K1) o per antiporto del nitrito (NAR/K2) Il primo passaggio è in comune ed è la riduzione del nitrato a nitrito E’ inibito dall’ossigeno E’ anaerobico Gli elettroni sono forniti dall’ossidazione anaerobica delle fonti C L’enzima è la nitrato reduttasi (NAR), proteina di membrana N2 NH3/NH4+ Azoto organico (R-NH2) NO2-/NO3- HNO3 + 2 e- + 2 H+ HNO2 + H2O NAR Fonte Cred Fonte Cox N2 NH4+ (A) (B) Denitrificazione Riduzione dissimilativa

L’ammonio non viene riassimilato come azoto organico (R-NH2) NH3/NH4+ Azoto organico (R-NH2) NO2-/NO3- La riduzione dissimilativa ad ammonio (B) è operata da molti batteri enterici: Bacillus, Clostridium L’ammonio non viene riassimilato come azoto organico (R-NH2) Meccanismo di riciclo del NADH/H+ (mantenimento stato redox)? La denitrificazione (respirazione del nitrato, A) è operata da molti batteri in condizioni di anaerobiosi: ossidano le sostanze organiche e trasferiscono gli elettroni al nitrato. Condizioni di base: Assenza di ossigeno Disponibilità del nitrato Presenza di sostanza organica (fonte C)

HNO3 + 2 e- + 2 H+ HNO2 + H2O NAR (membrana) o NAP (periplasmica) HNO2 + e- + H+ NO + H2O NIR (nitrito reduttasi, periplasmica) 2 NO + 2 e- + 2 H+ N2O + H2O NOR (NO ossidoreduttasi, membrana) N2O + 2 e- + 2 H+ N2 + H2O NOS (nitroso ossidoreduttasi, periplasmica) Le reazioni avvengono tutte nel periplasma salvo quella catalizzata da NAR di membrana che avviene nel citoplasma, previo trasporto del substrato (nitrato) per simporto o antiporto La sintesi di NAR e NIR è inibita dall’ossigeno e indotta dal nitrato Lo scambio degli elettroni è assicurato dai Cit c e Cit bc1 e dal menachinone (MQ)

γ-proteobatteri (Pseudomonas) I batteri denitrificanti sensu stricto sono quelli che effettuano tutti i passaggi fino a N2: α-proteobatteri (Magnetospirillum, Paracoccus, Magnetococcus, Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Brucella, Sinorhizobium, Bradyrhizobium) β-proteobatteri (Neisseria, Burkholderia, Cupriavidus, Ralstonia, Achromobacter, Alcaligenes) γ-proteobatteri (Pseudomonas) Gram-positivi (Corynebacterium, Bacillus) Archea (Pyrobaculum) Sono principalmente chemio-organotrofi, qualche fototrofo e chemio-litotrofo Esistono batteri denitrificanti parziali Magnetospirillum Cupriavidus Neisseria Corynebacterium Pyrobaculum

evaporazione e piogge acide Ecologia del ciclo dell’azoto: alterazioni antropiche che hanno provocato un aumento del volume di scambio dell’azoto tra organismi-suolo-acqua-atmosfera Fertilizzanti azotati Combustibili fossili Piante agronomiche in simbiosi con agrobatteri eccesso d’azoto azoto nelle acque Produzione annuale di N reattivo (Tg/anno) evaporazione e piogge acide origine 1860 1990 2050 Elettricità 5,4 N-fix terrestre 120 107 98 N-fix marina 121 Sintesi chimica 100 165 N-fix agronomica 15 31,5 50 Combustibili 0,3 24,5 52,2 Totale 261 389 491 eutrofizzazione N2O3 riduzione dell’ozono effetto serra

Amminoacidi (cisteina, metionina) Ciclo dello zolfo Zolfo organico: Amminoacidi (cisteina, metionina) Vitamine e cofattori (biotina, tiamina, coenzima A etc) Serbatoi dello zolfo: rocce (solfati e solfuri) e sedimenti marini (solfati) cisteina e metionina biotina e tiamina Coenzima-A

solfati Zolfo Zolfo organico elementare R-SH S0 H2S Principale fonte di zolfo solfati H2S Zolfo organico R-SH Zolfo elementare S0 Riduzione assimilativa (piante, microrganismi) Desolforazione/mineralizzazione (batteri e funghi non specializzati) Riduzione dissimilativa (batteri solfato-riduttori) Ossidazione anaerobica (batteri chemo-litotrofi e fotosintetici) Ossidazione spontanea o da microorganismi (solfobatteri aerobi) Assimilazione (trasformazione e incorporazione) & Dissimilazione (trasformazione e scarto)

Tioredossina dipendenti RSH H2S SO42- Riduzione assimilativa del solfato Solfato → R-SH Organicazione del solfato da parte di piante e microorganismi ATP + SO42- AMP-SO4- + 2 Pi P-AMP-SO4- ATP ADP (Adenosina-5-fosfosolfato; APS) (fosfo-adenosina-5-fosfosolfato; PAPS) Forme attivate del solfato Fonti di elettroni variabili a seconda dell’organismo APS/PAPS solfito Solfuro (RSH) e- Reduttasi APR PAPR Tioredossina dipendenti Solfito reduttasi SiR (NADPH/H+)

(lattato, propionato, etanolo …) S0 RSH H2S SO42- Riduzione dissimilativa del solfato/respirazione anaerobia del solfato: Solfato → solfuro Batteri solfato-riduttori o zolfo-riduttori (Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfomonas) Anaerobi obbligati Utilizzano elettroni derivanti dall’ossidazione di fonti C ridotte prodotte da altri batteri anaerobi Desulfovibrio Fonte C Fonti C ridotte (lattato, propionato, etanolo …) Batteri anaerobi CO2 Solfato-riduttori (Respirazione anaerobia) e- solfato solfito H2S secreto Desulfotomaculum

Ossidazione anaerobica dei solfuri: Solfuro → S0 → solfato RSH H2S SO42- Ossidazione anaerobica dei solfuri: Solfuro → S0 → solfato Batteri fotosintetici rossi (Ectothiorhodospira, Chromatium, Rhodospirillum) o verdi (Chlorobium) Fotosintesi senza produzione di ossigeno (utilizzano il solfuro invece dell’acqua) Batteri autotrofi (CO2) Ambiente anaerobico acquatico con accumulo di H2S Ectothiorhodospira Chromatium RSH/H2S Zolfo elementare/solfati elettroni CO2 biomassa hν Chlorobium

Desolforazione/mineralizzazione RSH (materiale organico) → (microrganismi non specializzati) → H2S H2S → (in condizioni aerobie: solfobatteri aerobi o ossidazione spontanea) → S(0) Solfobatteri aerobi: Thiothrix, Beggiatoa, Thiobacillus Alcuni Thiobacillus ossidano tutte le specie di zolfo (H2S, S e tiosolfato) a solfato L’ossidazione dello zolfo avviene a pH variabili (da 2 a 8,5) per successione di specie S0 RSH H2S SO42- Thiothrix Beggiatoa Thiobacillus

Fosfato insolubile e fissato nel suolo Ciclo del fosforo Composti conteneti fosforo: Acidi nucleici (monomeri e polimeri), ruolo energetico del fosfato (NTP) Cofattori (esempio TPP) Fosfolipidi Proteine (kinasi e fosfatasi, ruolo della fosforilazione delle proteine) Avviene senza cambi di stato di ossidazione ma di solubilità Fosfato insolubile e fissato nel suolo Fosfato solubile Fosforo organico Mineralizzazione da microrganismi generici Assimilazione da piante, microrganismi, animali Acido fitico (inositolo-6P) = forma di deposito vegetale di fosfato assimilato solo dai ruminanti