Analisi qualitativa: spettri di assorbimento nell’UV e nel VIS Il nostro occhio funziona come uno spettrofotometro che rivela la radiazione trasmessa dal cromoforo che ha assorbito solo una parte della luce solare composta da radiazioni nel VIS, nell’UV e nell’infrarosso Analisi qualitativa: spettri di assorbimento nell’UV e nel VIS Per un cromoforo in soluzione, se si registra in continuo l’assorbanza (Densità Ottiche, OD) in funzione della variazione della lunghezza d’onda (l, nm) si ottiene uno spettro di assorbimento in cui è possibile identificare una lunghezza d’onda di massimo assorbimento. Una cuvetta contenente il solo solvente funziona da “Bianco”.

Max assorbim. Amminoacidi arom. e proteine con aromatici = 280 nm Assorb legame peptidico= 220-230 nm Max assorbim. Nucleotidi e ac. nucleici = 260 nm

I Esercitazione: ESERCITAZIONE Determinazione dello spettro di assorbimento di: una soluzione in acqua di Albumina di Siero Bovino (BSA) da 240 a 320 nm una soluzione in acqua di blu destrano da 400 a 800 nm Operazioni da eseguire: 1-Selezionare allo spettrofotometro l’intervallo di lunghezze d’onda (240 - 320 nm oppure 400 - 800 nm) da utilizzare; 2- trasferire il campione nella cuvetta (quarzo x uv e vis; plastica o vetro solo per vis) 3- sistemare la cuvetta nell’apparecchio; 4- avviare la registrazione; 5- stampare lo spettro

Determinazione del coefficiente di estinzione Legge di Lambert-Beer: A=e x c x l l= 1cm , lunghezza del cammino ottico; c=concentrazione del soluto; A= assorbimento della luce ad una lunghezza d’onda opportuna x il campione in esame E= e=coefficiente di estinzione molare o percentuale

ESERCITAZIONE Calcolo della concentrazione della soluzione di BSA sapendo che il coefficiente di estinzione percentuale (E%) a 280 nm è di 6,75 O.D. OD = A

Svolgimento: Legge di L.-B. : A= E% x c x l Il soluto in esame e’ la proteina albumina di siero bovino (BSA), di cui non conosciamo la concentrazione in questa soluzione. Sappiamo, tuttavia, che E% a 280nm = 6.72 OD, cioe’ una soluzione 1% di BSA, misurata a 25°C, nelle stesse condizioni di pH e di [sale] di quella disponibile, a 280 nm ha un assorbimento = 6.72 OD. Nota: 1% = 1g di BSA / 100 ml di soluzione = 10mg/ml Applicando la legge di L.B.: Assorbimento della sol. in esame(misurato a 280nm)=6.72 x c x 1cm Da cui : c = Assorbimento della sol. in esame(misurato) x 10mg/ml 6, 72 x 1cm Il numero che si ottiene dal rapporto va moltiplicato per 10 per ottenere la [BSA] per millilitro di soluzione

MEMO Il saggio di attivita’ misura la velocita’ della reazione enzimatica a E e S costanti. La velocita’ si misura come [S] convertita in prodotto nell’unita’ di tempo (D(delta)/minuto). Nota: La curva di velocita’ si ottiene misurando ad ogni minuto la quantita’ di substrato rimasta, seguendo la reazione per un certo tempo (per esempio 10’-15’) L’Unita’ enzimatica /ml si calcola dividendo il D(delta)/minuto per il volume della soluzione di enzima utilizzato nel saggio L’attivita’ specifica di un enzima e’ uguale al rapporto delle Unita’ (U)/ml sui mg/ml di proteine presenti nel campione contenente l’enzima: Att. Sp.= U/ml = U mg/ml mg

DOMANDA Per controllare se , nel corso di una purificazione, l’enzima in esame si sta purificando (= liberando di proteine contaminanti), fareste riferimento a U/ml oppure a U/mg ??

Domanda Nella tabella successiva il Tris (tris idrossimetil amino metano, con un gruppo amminico ionizzabile), e’ utilizzato per preparare il tampone in cui saggiare l’attivita’ dell’enzima. Qual’e’ la funzione del HCl? A cosa serve la glicina? Perche’ e’ usata con il NaOH??

Schema dei saggi da eseguire Tampone Substrato 25 mM Acqua (a 1 ml) Enzima DA/min unità Tris-HCl 0,1 M, pH 7 500 ml 30 ml 470 ml 5 ml Tris-HCl 0,1 M, pH 8 500 ml 30 ml Glicina-NaOH 0,1 M, pH 9 500 ml Glicina-NaOH 0,1 M, pH 10 500 ml Glicina-NaOH 0,1 M, pH 12 500 ml