Nella sua espressione più semplice, la fermentazione è la seguente: glucosio → 2 etanolo + 2 CO2 + energia   Produzione di etanolo come solvente o combustibile (competizione con la sintesi chimica) Produzione di bevande (vino, birra etc) Produzione di bevande distillate (liquori) (produzione di biomassa di lievito)

Il lievito: • caratteristiche dell'organismo • caratteristiche metaboliche e fisiologiche relativamente al prodotto • caratteristiche organolettiche del prodotto • specie e/o varieta’ utilizzate 1. Saccharomyces cerevisiae (etanolo) 2. S. carlsbergensis (birra) 3. S. ellipsoideus, S. apiculatus, S. bayanus, S. uvarum e altri tipizzanti (vini) • Tipi di lieviti 1. Lieviti ‘alti’: fermentano ad alta temperatura, crescono in superficie e formano pseudo-miceli 2. Lieviti ‘bassi’: fermentano a bassa temperatura, crescono a cellule singole

Figura 1. 3. 15 - Schema della glicolisi Figura 1.3.15 - Schema della glicolisi. Sono indicati i metaboliti e gli enzimi glicolitici. Il primo passaggio è il trasporto del glucosio dall’ambienta all’interno della cellula, operato da specifici trasportatori del glucosio o degli esosi, in generale. Sono segnati i passaggi che consumano o sintetizzano ATP e NADH/H+. La reazione è bilanciata come massa solo quando il NADH/H+ prodotto viene riossidato nella fermentazione o nella respirazione.

Figura 15. 3. 1 - La via ciclica dei pentosi Figura 15.3.1 - La via ciclica dei pentosi. La CO2 ed il potere riducente (NADPH/H+) prodotti ad ogni ciclo rendono conto di una mole di glucosio ogni sei cicli interi, escludendo dunque l’eventuale sottrazione di intermedi per le vie biosintetiche primarie.

glucosio glicolisi red ox piruvato acetaldeide + CO2 etanolo ADP ATP CICLO TCA CATENA RESPIRATORIA O2 H2O POOL BIOMASSA + BIOSINTESI fermentazione respirazione

METABOLISMO DEL GLUCOSIO E DEL PIRUVATO IN LIEVITO ALTRE FONTI C RESPIRAZIONE GLUCONEOGENESI biosintesi

Caratteristiche ottimali del processo: Rese elevate del prodotto ( riduzione dei costi in materia prima) Velocita’ elevata di fermentazione ( riduzione dei tempi di lavoro dell’impianto) Elevata tolleranza all’etanolo Elevata tolleranza al calore (28-35°C) Elevata tolleranza all’acidita’ (pH 3.5-6) Nella fermentazione alcolica abbiamo la trasformazione di una mole di glucosio in due di etanolo e due di anidride carbonica. Dato che una mole di glucosio pesa 180 g ed una di etanolo 46 g: 180 g glucosio → 92 g etanolo + 88 g CO2 Ovvero da 100 g di glucosio otterremo 51 g di etanolo, con una resa (Y) di 0,51. Questo valore è teorico in quanto una parte, anche se piccola, del glucosio viene utilizzato per produrre biomassa (circa 2 grammi per grammo di biomassa prodotta) e sintesi dei prodotti secondari della fermentazione. Quindi in pratica le rese dei processi fermentativi col lievito si aggirano intorno al 90-95% della resa teorica: Y = 0,46-0,48.

L’ossigeno nella fermentazione alcolica: Ossigeno come fattore nutrizionale (reazioni redox citoplasmatiche/biosintetiche) Regolatore del metabolismo (es.: piruvato decarbossilasi) Tensione tipica: 0,05-0,1 mm Hg (se maggiore si ha effetto Pasteur)   L’inibizione della crescita da parte dell’etanolo: 1-2% (10-20 g/L)  rallentamento crescita (sintesi proteica?) 10%  inibizione (denaturazione enzimi ?) resistenza ad etanolo  composizione membrana ? (trasporto)

Flocculazione

Molti batteri producono etanolo (tabella), ma insieme a vari prodotti secondari, a seconda delle vie metaboliche presenti: altri alcol (butanolo, isopropanolo, dioli etc) acidi organici (acidi acetico, butirrico, formico, lattico etc) chetoni o polioli gas (metano, idrogeno)

Il batterio piu’ utilizzato e’ Zymomonas mobilis, che produce essenzialmente etanolo senza prodotti secondari: Gram-negativo, bastoncellare, flagellato, anaerobio facoltativo Bevande fermentate in pesi tropicali cresce anaerobicamente su zuccheri anche a concentrazione elevate (40%) elevata velocità di uptake e consumo di glucosio, fruttosio, saccarosio elevata tolleranza a etanolo (16%) resa in etanolo elevata (quasi teorica 2mol/mol), poca biomassa (1 ATP/mol) e’ uno dei pochi batteri con la PDC, due geni per ADH PDC e ADH molto espressi metabolizza il glucosio tramite la via di ENTNER-DOUDOROF (ED) puo' essere utilizzato in coltura continua (figura) manipolabile geneticamente (uso dei pentosi?) completamente sequenziato il suo operone ADH+PDC usato per ingegnerizzare batteri che usano fonti C a basso costo (es composti ligno-cellulosici)

Enzimi caratteristici della via ED: Deidratasi KDGP aldolasi

ALCOL DA TERMOFILI   I processi che usano batteri termofili (es Thermoanaerobacter ethanolicus) offrono alcuni vantaggi: aumentata efficienza del processo (alta produttività e tempi brevi) bassa solubilità dell'ossigeno (anaerobiosi facilitata) Solubilità maggiore di alcuni substrati bassa viscosità Facilità di recupero del prodotto per evaporazione (processi sotto vuoto) condizioni di sterilità

SISTEMI IMMOBILIZZATI IN CONTINUO   La produzione di etanolo con cellule immobilizzate ha come vantaggio principale la possibilita' di lavorare a D>max Problemi di diffusione del substrato/prodotto si possono ovviare tecnicamente (piccole dimensioni delle particelle del supporto) La produttivita' varia con D e ha un valore ottimale (esempio figura) in corrispondenza del massimo di uptake glucosio (qs) e produzione di etanolo (qp) L'inibizione da etanolo (adsorbimento a matrice?) e/o glucosio (velocita' diffusione) sono ridotte Gli effetti della temperatura (alte T = velocita' di produzione > velocita' di diffusione: inibizione da etanolo?) e pH (effetto tampone del supporto o gradiente pH?): figure In ogni caso le PRODUTTIVITA' dei sistemi immobilizzati sono piu' elevate dei sitemi a cellule libere (tabella)

Z. mobilis

COMPOSIZIONE DEL TERRENO componenti maggiori: fonte C (zuccheri fermentabili) ed N componenti minori: P, S, K e Mg tracce: minerali, vitamine, fattori di crescita   Alcuni componenti (es sali di ammonio e fosfati) possono essere provvisti individualmente o da fonti a basso costo (es CSL

MATERIE PRIME PER LA FERMENTAZIONE   La scelta delle materie prime dipende dall’impiego del prodotto finale: prodotti alimentari  scelta obbligata produzione di combustibile o solvente  costi e disponibilita’ (locali) fonte di carbonio  zuccheri sotto forma di monomeri/dimeri o polimeri (amidi o cellulosa) saccarificazione dei polimeri (velocita' di assimilazione)  amilasi, cellulasi, glucanasi o altri trattamenti chimico-fisici (tabella di utilizzazione degli zuccheri in lievito). Le materie prime sono in genere sottoprodotti o materiale di scarto di altre lavorazioni, che rimarrebbe altrimenti inutilizzato (problema dello smaltimento): melasse di canna da zucchero o barbabietola composti amidacei scarti della lavorazione della cellulosa siero di latte eccedenze produttive o scarti della produzione di frutta o altri vegetali Alcuni problemi connessi alla produzione di etanolo: problema morale  scelta tra colture per l’alimentazione o per la produzione di etanolo problema ambientale  monocoltura intensiva.

BATCH: rappresentano la maggior parte dei processi in uso e derivano dalle conoscenze accumulate per la produzione di bevande Tempi di processo: 3-4 giorni Temperatura: 10-30°C pH: 4-5 Rese: 90-95% del teorico Etanolo finale: 10-16%   Vantaggi Facilita' operativa Non richiede personale e conoscenze specializzate Basso rischio economico Svantaggi Tempi morti dopo il processo Fase lag improduttiva

SEMICONTINUO: si elimina la fase lag

CONTINUO Idealmente è il processo migliore in quanto permette di: eliminare i tempi morti (fase lag e i tempi di scarico-lavaggio-carico degli impianti) elevate produttività (cellule sempre in fase log): la produttività maggiore si ottiene a D con il miglior compromesso tra produttività specifica e biomassa (figura). Si può incrementare la produttività ad alte D (bassa concentrazione di cellule) utilizzando sistemi di riciclo della biomassa raccolta. In questo caso è necessaria la separazione delle cellule dal terreno (centrifugazione, sedimentazione, filtrazione)   Gli svantaggi sono: possibili inquinamenti mantenimento dello STATO STAZIONARIO

Figura 14 F1 FX F2 X S0 P S X FS P X S P S S P

  1° fase: preparazione dell’inoculo o precoltura 2° fase: fermentazione vera e propria 1° fase: fermentazione aerobia (es. fed-batch  max quantità di cellule nel tempo minore) a basso pH (4-4.5) e temperatura (20°C) per evitare inquinamenti 'scaling up' del volume della precoltura, mantenendo le cellule in fase esponenziale (minimizzare le fasi lag) 2° fase: inoculo del fermentatore e avvio del processo anaerobio (28-30°C, senza agitazione, lo strato di CO2 contribuisce a mantenere l’anaerobiosi) La fonte di carbonio va determinata con cura: deve essere tutta consumata alla fine della fermentazione. Bisogna considerare: concentrazione finale del prodotto (9-10%) rese Y del prodotto Ad esempio: data una concentrazione finale di 9% etanolo  90 g/L con una resa di 0.45, pari a 90% del teorico (0.51) calcolo un concentrazione iniziale di 200 g/L di glucosio 2000.45=90

biomassa: poca e non vantaggiosamente utilizzabile residuo della distillazione: alto BOD, recuperabile come fertilizzante/mangime CO2 Olio di fusello (componenti meno volatili dell’etanolo) Glicerolo

OLIO DI FUSELLO alcoli amilico, isoamilico, isobutilico + vari acidi, aldeidi ed esteri nel caso dei prodotti alimentari contribuiscono alle caratteristiche organolettiche del prodotto la struttura dei componenti non deriva dal glucosio, ma piuttosto dagli aminoacidi  

GLICEROLO Deriva dalla riduzione del DHAP   Si può ottenere un eccesso di glicerolo sbilanciando il potenziale redox della cellula, aggiungendo bisolfito (che reagisce con l’acetaldeide) o alzando il pH (l’acetaldeide disproporziona in etanolo e acetato): l’eccesso di NADH spinge alla formazione di glicerolo. Attualmente il glicerolo si ottiene vantaggiosamente dall’idrolisi dei trigliceridi.