Preparazione Dei Campioni per l'Analisi Istologica Come si preparano le sezioni istologiche per la microscopia ottica

Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia Ottica Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3) Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi)

Fissaggio del campione Immobilizzare, "uccidere" e preservare Generalmente per mezzo di aldeidi reattive (formaldeide) Cross-link delle macromolecole, in particolare le proteine Si ottiene un effetto indurente sui tessuti "molli” Deve essere fatto rapidamente per evitare che gli enzimi presenti degradino il tessuto

Eliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene Disidratazione del campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo Paraffina (materiale usato per l'inclusione) non è solubile in H2O Eliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene Paraffina non è solubile nemmeno nell'etanolo

Inclusione del campione in un mezzo appropriato Paraffina o resina Tessuti sono "molli" e fragili Diversi passaggi in paraffina calda La paraffina occupa lo spazio precedentemente occupato dall'H2O La paraffina fredda si indurisce e permette di sezionare il campione

Taglio per mezzo di un microtomo Produce sezioni dello spessore di 1-10 µm Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia Sezione non colorata

Colorazione delle sezioni con il metodo più appropriato I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo Colorazione automatizzata

Colorazioni Colorazione Contro colorazione Con un colore brillante di certe componenti del tessuto Contro colorazione Del resto del tessuto con un colore contrastante

Ematossilina/Eosina Ematossilina Eosina Affinità per le molecole cariche negativamente DNA, RNA ed alcune proteine Eosina Affinità per le molecole cariche positivamente Proteine del citosol

Perchè questa "slide" è blu … Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila È colorata dall'ematossilina Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili

… e questa rossa ? Se una porzione si colora in rosso /arancio/rosa, viene detta acidofila o eosinofila È colorata dall'eosina Sono le proteine del citosol

Altre colorazioni PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff) Le aree bianche sono lipidi PAS (Acido Periodico-Reattivo di Schiff) Per sostanze ricche in zuccheri (muco) Tricromica o Hazan-Mallory Per i tessuti connettivi Le fibre si colorano in blu Con E&E sono rosa Adiposo Bianco

Osmio o Sudan black Argento ed oro Giemsa Per grasso/lipidi/mielina Cellule nervose Cellule del sangue Osmio o Sudan black Per grasso/lipidi/mielina I lipidi non incorporano coloranti acquosi Argento ed oro Per fibre delicate e processi cellulari Giemsa Per le cellule del sangue Simile ad E&E

E le aree "bianche"? I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E Sangue, linfa etc. Si riconoscono come ampi spazi bianchi Anche i lipidi ed il grasso non si colorano Mesenchima

Come si osserva il campione? Attraverso un buon microscopio ottico Fotografandolo Misurandolo Per avere un'idea delle dimensioni delle strutture osservate si può usare come riferimento un eritrocita (˜ 8 micron)

Interpretate il campione !!!

Interpretate il campione !!! Dovete “pensarlo” in 3 dimensioni Sezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione

Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali

“Artefatti” Shrinkage Fratture al piano di taglio Lascia dello spazio aggiuntivo Disidratazione e fissaggio Fratture al piano di taglio Tagli netti e ben visibili Lama deteriorata

Colorante precipitato Macchie di colore a "grano di pepe” Tessuto "pinzato" Strumento per l'excisione deteriorato Durante o dopo il sezionamento Pieghe Durante il montaggio