Microscopi e tecniche Microscopiche 2 parte

Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia. Taglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10mm. Montaggio delle sezioni su vetrini per microscopia. Sezione non colorata

Tagliare fettine così sottili di campioni biologici di diversa consistenza può essere problematico -Ecco perché occorre INCLUDERE -Esistono diversi mezzi di inclusione che conferiscono diversa consistenza ai campioni. PARAFFINA RESINA MIX DI PARAFFINA E RESINE

Colorazione delle sezioni con il metodo più appropriato. I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo. Colorazione automatizzata

Colorazioni Colorazione con un colore brillante di certe componenti del tessuto Contro colorazione del resto del tessuto con un colore contrastante

Ematossilina/Eosina Ematossilina ha affinità per le molecole cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine). Eosina ha affinità per le molecole cariche positivamente (proteine del citosol).

Perchè questa "slide" è blu … Se una porzione di tessuto o di una cellula si colora di blu/porpora, viene detta basofila È colorata dall'ematossilina Nuclei e ribosomi generalmente sono basofili

… e questa rossa ? Se una porzione si colora in rosso /arancio /rosa, viene detta acidofila o eosinofila È colorata dall'eosina Sono proteine del citosol

Altre colorazioni PAS Per sostanze ricche in zuccheri (muco) Tricromica (Azan Mallory) * Per i tessuti connettivi Le fibre si colorano in blu Con E&E sono rosa. Adiposo Bianco Le aree bianche sono lipidi

Osmio o Sudan black Argento ed oro Giemsa Per grasso /lipidi/mielina I lipidi non incorporano coloranti acquosi Argento ed oro Per fibre delicate e processi cellulari Giemsa Per le cellule del sangue Simile ad E&E Mielina Cellule nervose Cellule del sangue

Come si osserva il campione? Attraverso un buon microscopio ottico Fotografandolo Misurandolo Per avere un'idea delle dimensioni delle strutture osservate si può usare come riferimento un eritrocita (˜ 8 micron)

Interpretate il campione!!! Dovete pensare in 3 dimensioni Sezioni seriali sono l'ideale per l'interpretazione e la ricostruzione

Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali

Microscopia Elettronica a Trasmissione Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta Alta risoluzione Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi Gli elettroni passano attraverso il campione

MICROSCOPIA ELETTRONICA Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) limite di risoluzione di questo strumento è di 0,2 nm Un fascio di elettroni attraversa il campione e viene proiettato su uno schermo che trasforma in toni di grigio il numero di elettroni da cui viene colpito. Condensatore e obiettivo non sono costituiti da lenti, ma da campi magnetici, che hanno lo scopo di deviare le traiettorie degli elettroni verso l'asse.

La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico Risoluzione dell'occhio: 0.2 mm = 200 µm Risoluzione del MO: 2,000 Angstroms = 200nm Risoluzione del TEM: 2 Angstroms 1 mm = 1000 µm 1 µm = 1000 nm 1 nm = 10 Angstroms Pinocitosi

Microscopia elettronica -I campioni devono essere molto più sottili di quelli per il microscopio ottico a luce trasmessa -Non vengono usati coloranti ma sostanze dense agli elettroni semplicemente per dare contrasto o anche per marcare anticorpi

Preparatione del campione Fissazione glutaraldeide Tetrossido osmio Cellula eucariotica Nucleo interfasico Fissazione glutaraldeide Tetrossido osmio Deidratazione etanolo (passaggi) Inclusione Resine plastiche Taglio ultramicrotomo (spessore 50-100 nm) Colorazione Metalli pesanti

Preparazione di Campioni Biologici per TEM 1 Acquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3) 2 Fissaggio del campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio L’osmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi, rendendoli elettrondensi (neri) Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni appaiono chiari.

Disidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo. Inclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina.

Taglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro). La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mm. Lo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm).

Montaggio delle sezioni su di una griglia. Colorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo. Visualizzazione al TEM Fotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

Vari tipi di Microscopia Elettronica Transmissione (TEM) Scansione (SEM) Shadow-casting Freeze-fracture Freeze-etching CryoEM Negative Staining

Microscopia Elettronica a Scansione SEM fa una scansione della superfice del campione Produce immagini 3-D

IL MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM) Nel SEM (ed in genere nella microscopia elettronica) viene sfruttata l’interazione di un fascio di e- con il campione per ricavare informazioni sul campione stesso come nel microscopio luce a riflessione viene utilizzato un fascio di fotoni

Non vengono registrati gli e- che attraversano il campione bensì quelli secondari che sono emessi a seguito dell’urto del fascio di elettroni contro di esso

Tridimensionalità La caratteristica preminente delle immagini ottenute con il SEM è l’eccezionale tridimensionalità - Ciglia e microvilli

Glomerulo renale

Preparazione dei campioni per SEM Acquisizione del campione Trattandolo con cura in modo da non danneggiare la superficie Fissazione e disidratazione Non si include

Poggiato su di un supporto e ricoperto con um metallo Oro, cromo, palladio, carbone Deve essere elettron-conducente (non elettrondenso) Visualizzato al microscopio Fotografato Si possono analizzare le componenti chimiche tramite raggi X