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Lezioni di biochimica 2 2

Il metabolismo dei carboidrati Lezione 5 Il metabolismo dei carboidrati 3 © Zanichelli editore, 2014 3

La produzione di energia: catabolismo dei nutrienti La degradazione enzimatica delle sostanze nutritive principali, carboidrati, lipidi e proteine, procede attraverso una serie di reazioni enzimatiche che hanno lo scopo ultimo di generare energia chimica. Questa energia viene utilizzata per tutte le reazioni cellulari, ivi comprese quelle anaboliche (biosintesi). © Zanichelli editore, 2014 4 4

Il catabolismo dei carboidrati: la glicolisi (I) La glicolisi è propriamente la via di degradazione del glucosio (a 6 atomi di C) a piruvato (a tre atomi di C). In condizioni anaerobie, il piruvato sarà ridotto ad acido lattico (fermentazione lattica). In condizioni aerobie, il piruvato sarà usato per generare acetil-CoA (a due atomi di C) che entrerà nel ciclo di Krebs. La resa energetica della fermentazione è di 2 ATP per molecola di glucosio, mentre quella dell’ossidazione completa del glucosio nella respirazione è molto più elevata: 32 ATP per molecola di glucosio. © Zanichelli editore 2014 5 5

Le reazioni della glicolisi Nella glicolisi avengono tre serie di reazioni interdipendenti: La via del carbonio, ovvero la degradazione dello scheletro carbonioso del glucosio a 6 C in due molecole a 3 C. La via del fosfato, ovvero le reazioni che trasferiscono fosfato inorganico (Pi) ad ADP per generare ATP. La via degli elettroni, ovvero le reazioni di ossidazione che trasferiscono elettroni all’accettore NAD+. © Zanichelli editore, 2014 6 6

Le fasi della glicolisi Queste tre serie di reazioni sono organizzate in due fasi principali: La fase di preparazione, in cui viene investita l’energia di 2 ATP per generare il Fruttosio 1,6-difosfato. La fase di recupero, in cui si generano due piruvato e si producono 4 ATP. © Zanichelli editore, 2014 7 7

La fase di preparazione (I) Questa fase inizia con la fosforilazione del glucosio a glucosio-6-P, da parte degli enzimi esochinasi o glucochinasi con utilizzo di un ATP. Dopo l’isomerizzazione del glucoso-6-P a fruttosio-6-P, si ha il secondo investimento di energia con la fosforilazione a fruttosio 1,6-difosfato da parte della fosfofruttochinasi, utilizzando un secondo ATP. © Zanichelli editore, 2014 8 8

La fase di preparazione (II) In questa fase lo scheletro di carbonio rimane intatto (6 atomi), ma viene generato un esoso fosforilato ad elevata energia (fruttosio 1,6-difosfato). L’ultimo passaggio prevede la scissione dell’esoso in due molecole di gliceraldeide 3-P (a 3 C). Questo passaggio richiede due enzimi: l’aldolasi e la fosfotrioso isomerasi. © Zanichelli editore, 2014 9 9 9

La fase di preparazione (III) © Zanichelli editore, 2014 10 10

L’esochinasi La esochinasi, o glucochinasi, è presente in tutte le cellule che fanno la glicolisi. È in grado di fosforilare molti esosi (mannosio e fruttosio ad esempio) ed è inibita dal prodotto della reazione (glucoso-6-P). Quando la cellula ha soddisfatto il suo bisogno di ATP, si accumula glucosio-6-P che inibisce la glicolisi. © Zanichelli editore, 2014 11 11

La glucochinasi La glucochinasi è specifica per il glucosio ed è presente nel fegato e non è inibita dal glucoso-6-P. Questa differenza rispecchia i differenti metabolismi cellulari: il fegato è il principale regolatore della glicemia, quindi deve essere in grado di operare la glicolisi in risposta non solo al fabbisogno energetico ma anche alla concentrazione di glucosio del sangue. © Zanichelli editore, 2014 12 12 12

Il fruttosio-6-P nell’utilizzo degli esosi Il fruttoso-6-P rappresenta l’intermedio comune all’utilizzazione di zuccheri diversi dal glucosio. Il fruttosio entra nella glicolisi come fruttosio-6-P a seguito della fosforilazione da parte della fruttochinasi. Il mannosio viene fosforilato a mannosio-6-P dalla esochinasi e poi convertito a fruttosio-6-P da una specifica isomerasi. Quindi, anche l’ingresso di zuccheri diversi dal glucosio richiede sempre un passaggio di fosforilazione. © Zanichelli editore, 2014 13 13

La fase di rendimento (I) A partire da ciascuna delle due molecole di gliceraldeide-3-P sono generate due molecole di ATP. Il passaggio chiave è l’aggiunta di un fosfato per dare 1,3 difosfoglicerato. Questa reazione è operata da una deidrogenasi specifica e la sua importanza è che l’energia ottenuta dall’ossidazione del gruppo aldeidico viene conservata nel legame del gruppo fosforico. Gli elettroni generati dall’ossidazione sono trasferiti al NAD+ per dare NADH+H+ (che verrà usato alla fine della via glicolitica). Il prodotto 1,3 difosfoglicerato è un composto fosforilato ad alta energia che viene generato senza consumo di ATP. © Zanichelli editore, 2014 14 14

La fase di rendimento (II) Nelle tappe successive si hanno due fosforilazioni a livello del substrato. La prima (catalizzata dalla fosfoglicerato chinasi) trasferisce uno dei due gruppi fosfato dell’1,3-difosfoglicerato all’ADP formando ATP e 3-fosfoglicerato. Il secondo gruppo fosfato viene spostato da una mutasi dal C3 al C2 formando il 2-fosfoglicerato, che può essere convertito in fosfoenolpiruvato dall’enolasi. Il fosfoenolpiruvato può adesso funzionare da donatore di un gruppo fosforico all’ADP, nella seconda fosforilazione a livello del substrato (catalizzata dalla piruvato chinasi) per generare ATP e piruvato. © Zanichelli editore, 2014 15 15

La fase di rendimento (III) Alla fine si generano quindi 4 ATP (due per ogni gliceraldeide-3-P presente all’inizio) e 2 molecole di piruvato. © Zanichelli editore, 2014 16 16

Una reazione accoppiata permette il completamento della glicolisi (I) L’ossidazione della gliceraldeide-3-P a 1,3-difosfoglicerato ha un ∆G di reazione leggermente positivo (+1.5 kcal x mol-1), per cui potrebbe procedere anche in senso inverso (che ha invece un ∆G di pari valore ma negativo), rallentando la glicolisi. L’enzima che catalizza il passaggio successivo (fosfoglicerato chinasi) ha però un’affinità molto elevata per l’1,3-difosfoglicerato, e lo sottrae così alla deidrogenasi. © Zanichelli editore, 2014 17 17

Una reazione accoppiata permette il completamento della glicolisi (II) La fosforilazione a livello del substrato della chinasi ha invece un ∆G fortemente negativo (-4,5 kcal x mol-1), quindi procede rapidamente. Il ∆G finale è quindi (-4,5 + 1,5) = -3 kcal x mol-1. Questo accoppiamento rende perciò possibile il proseguimento della glicolisi. © Zanichelli editore, 2014 18 18 18

Destino del piruvato in condizioni anaerobie: fermentazione lattica In condizioni anaerobie, la glicolisi procede riducendo il piruvato a lattato (fermentazione lattica). Gli elettroni necessari sono forniti dal NADH+H+ generatosi nella fase di rendimento. © Zanichelli editore, 2014 19 19

Destino del piruvato in condizioni anaerobie: fermentazione alcolica In alcuni lieviti (ad es. birra) avviene invece la fermentazione alcoolica, in cui il piruvato è prima decarbossilato (perde 1 C) ad acetaldeide (+ CO2) che viene poi ridotta (usando il NADH+H+) a etanolo. © Zanichelli editore, 2014 20 20 20

Destino del piruvato in condizioni aerobie: l’Acetil CoA In condizioni aerobie, il piruvato è importato all’interno dei mitocondri. Qui, il complesso della piruvato deidrogenasi, opera una decarbossilazione, in cui il piruvato a 3C viene trasformato in acetil-CoA (a 2C) + CO2. Gli elettroni generati sono ceduti al NAD+. L’acetil-CoA così formato entra nel ciclo di Krebs. © Zanichelli editore, 2014 21 21

Considerazioni finali sul bilancio energetico della glicolisi (I) Nella glicolisi abbiamo visto il trasferimento di 2 fosfati da ATP ad un esoso (glucosio e fruttosio) e di due fosfati dall’acido fosforico a due triosi (gliceraldeide-3-P). Questi 4 fosfati vengono poi donati nuovamente all’ADP per formare 4 ATP. Dato che due ATP erano stati consumati, il bilancio netto è di 2 ATP. © Zanichelli editore, 2014 22 22

Considerazioni finali sul bilancio energetico della glicolisi (II) Il passaggio chiave che consente il guadagno energetico è l’utilizzo del fosfato inorganico (dall’acido fosforico) per generare l’ 1,3-difosfoglicerato. La delucidazione di questo meccanismo ha fornito la prima prova che l’energia derivata dall’ossidazione di una molecola organica può essere conservata sotto forma di ATP. © Zanichelli editore, 2014 23 23 23

Considerazioni finali sul bilancio energetico della glicolisi (III) Il prodotto della fermentazione lattica (lattato) contiene ancora molta energia, per cui la glicolisi anaerobia non è molto efficiente. L’ossidazione completa del piruvato attraverso il ciclo di Krebs, invece, rilascia tutta l’energia disponibile del glucosio. La differenza è notevole: circa 15 volte, come si vede confrontando i ∆G° complessivi della fermentazione e dell’ossidazione completa: Glucosio -> 2 Lattato, ∆G° = -47 kcal x mol-1 Glucosio + 6 O2 -> 6CO2 + 6H2O, ∆G° = -686 kcal x mol-1 © Zanichelli editore, 2014 24 24

La gluconeogenesi riparte dal piruvato (I) La biosintesi del glucosio nel fegato inizia con il piruvato, che quindi costituisce non solo un intermedio da cui si ricava energia nella respirazione ma anche il precursore del glucosio neosintetizzato. Perché la gliconeogenesi inizi, il piruvato deve trovarsi nel mitocondrio. Qui, invece che essere decarbossilato ad acetil-CoA, il piruvato può venire carbossilato (acquista 1 C) dalla piruvato carbossilasi (usando 1 ATP) generando ossalacetato. © Zanichelli editore, 2014 25 25

La gluconeogenesi riparte dal piruvato (II) L’ossalacetato è un importante intermedio del ciclo di Krebs, quindi la reazione della piruvato carbossilasi serve sia a rifornire il ciclo (reazione anaplerotica) sia a generare intermedi per l’anabolismo. © Zanichelli editore, 2014 26 26 26

Lo shuttle del malato (I) L’ossalacetato normalmente è convogliato nel ciclo di Krebs, quindi è importante che non esca dal mitocondrio. Per poter essere utilizzato per le successive tappe della gliconeogenesi (che avvengono nel citosol), l’ossalacetato è ridotto a malato (usando NADH+H+) dalla malato deidrogenasi mitocondriale. Il malato può uscire dal mitocondrio grazie ad un sistema di trasporto specifico. © Zanichelli editore, 2014 27 27

Lo shuttle del malato (II) Una volta nel citosol, il malato viene ri-ossidato a ossalacetato dalla malato deidrogenasi citosolica ed entra così nella via biosintetica del glucosio. Quindi, grazie alla separazione nei due compartimenti cellulari differenti (mitocondrio e citosol), lo stesso enzima può catalizzare la reazione diretta (riduzione) e il suo inverso (ossidazione). © Zanichelli editore, 2014 28 28 28

L’ossalacetato entra nella gluconeogenesi: il fosfenolpiruvato L’ossalacetato non è un intermedio della via glicolitica, ma può essere convertito in fosfoenolpiruvato. Questa reazione richiede una decarbossilazione (perdita di 1 C) e una fosforilazione, a spese di un GTP (guanosina trifosfato). L’enzima coinvolto è la fosfoenolpiruvato carbossi-chinasi. Il fosfoenolpiruvato adesso puo’ essere convertito a fruttosio 1,6-difosfato percorrendo a ritroso le tappe della glicolisi (con l’impiego di 1 ATP). © Zanichelli editore, 2014 29 29

La gluconeogenesi non è l’inverso della glicolisi (I) Il passaggio chiave della biosintesi del glucosio è la trasformazione di fruttosio 1,6-difosfato in fruttosio 6-P. La reazione glicolitica (fosfofruttochinasi che fosforila il fruttosio 6-P al C1) è infatti irreversibile (∆G° = -3,4 kcal x mol-1). Interviene allora un enzima che opera solo nella via biosintetica: la fruttosio difosfatasi che toglie il fosfato al C1, generando fruttosio 6-P, che potrà essere poi riconvertito a glucosio 6-P dalla isomerasi e infine a glucosio libero da un altro enzima unico della via biosintetica, la glucosio-6-fosfatasi, presente nel fegato. © Zanichelli editore, 2014 30 30

La gluconeogenesi non è l’inverso della glicolisi (II) Quindi, è evidente che la biosintesi del glucosio non è l’inverso della sua degradazione. Via glicolitica Via gluconeogenetica © Zanichelli editore, 2014 31 31 31

La gluconeogenesi e glicogenosintesi Il glucosio-6-P può venire utilizzato in molte cellule (fegato, muscolo) per sintetizzare il glicogeno, un’ importante riserva di energia. Il glucosio 6-P viene isomerizzato a glucosio 1-P e poi trasformato in UDP-glucosio (usando una molecola di UTP). A questo punto l’unità di UDP-glucosio viene aggiunta dalla glicogeno sintasi alla catena di glicogeno. © Zanichelli editore, 2014 32 32

La demolizione del glicogeno Il glicogeno può essere demolito generando unità di glucosio 1-P, grazie alla glicogeno fosforilasi. Il glucosio 1-P viene poi isomerizzato a glucosio 6-P e defosforilato a glucosio libero come visto nella gluconeogenesi. © Zanichelli editore, 2014 33 33

La regolazione di glicolisi e gluconeogenesi è speculare (I) I punti di controllo principali delle due vie anabolica e catabolica del glucosio si trovano all’inizio e alla fine dei rispettivi processi. La glicolisi è regolata infatti a livello della fosfofruttochinasi (da fruttosio 6-P a fruttosio 1,6 difosfato) che è inibita da ATP e citrato e attivata da AMP e ADP. Specularmente, la reazione corrispondente nella gluconeogenesi (da fruttosio 1,6 difosfato a fruttosio 6-P) è regolata dalla fruttosio difosfatasi, che viene attivata da ATP e citrato e inibita da AMP e dal fruttosio 1,6 difosfato. © Zanichelli editore, 2014 34 34

La regolazione di glicolisi e gluconeogenesi è speculare (II) Un altro punti di controllo della glicolisi è a livello della piruvato chinasi (che genera il piruvato), inibita da ATP e NADH. Specularmente, nella gluconeogenesi, la piruvato carbossilasi (che usa il piruvato per fare ossalacetato) è stimolata da acetil-CoA. Quindi, in presenza di eccesso di ATP, citrato, aceti-CoA, viene stimolata la gluconeogenesi e la glicogenosintesi (il glucosio non serve più come fonte di energia ma viene messo in riserva). Al contrario, in presenza di ADP, AMP e fruttosio 1,6 difosfato, viene stimolata la glicolisi (carenza di ATP e/o eccesso di glucosio). © Zanichelli editore, 2014 35 35