Canali voltaggio-dipendenti per il Na+

Il modello “standard” (o “canonico”) Elementi fondamentali sono: I soliti 4 domini (pseudo-subunità) disposte in cerchio, ognuna con 6 STM; il filtro di selettività, dato dalla giustapposizione delle 4 “regioni P” interposte tra S5 ed S6; le gates di attivazione, disposte all’imboccatura citoplasmatica del canale; i sensori del voltaggio: i 4 STM S4; la gate di inattivazione (modello “ball and chain”, sviluppato studiando i canali del K+).

In verde: siti di legame per la TTX Il canale voltaggio-dipendente del Na+ (NaV), clonato all’Università di Kyoto da Numa e Coll. E’ costituito da un’enorme subunità alfa, solitamente associata a subunità accessorie. Le anse extracellulari sono abbondantemente glicosilate, quelle intracellulari possiedono siti di fosforilazione. In verde: siti di legame per la TTX h: gate di inattivazione

Inattivazione rapida del canale del Na: Avviene per mezzo di un meccanismo del tipo “ball and chain”: una regione citoplasmatica (la particella di inattivazione) occlude il poro legandosi ad una regione adiacente (il sito di attracco). Particella di inattivazione: porzione dell’ansa citoplasmatica che connette i domini III e IV (cruciale la regione IFMT – ile-phe-met-thr). Sito di attracco: regioni multiple comprendenti: i) ansa citoplasmatica che connette S4 a S5 dei domini III e IV; ii) estremità citoplasmatica di S6 nel dominio IV. L’inattivazione rapida può essere modulata da interazioni con le subunità b.

Inattivazione lenta del canale del Na: E’ un processo completamente distinto dall’inattivazione rapida che potrebbe derivare da un riarrangiamento strutturale del poro, simile all’inattivazione di tipo C dei canali del K. Si è osservato che l’inattivazione “di tipo C” dei canali del Na è sensibile al K+ extracellulare (viene accelerata). Questo è interessante, perché nei periodi di intensa attività il K+ si accumula nel mezzo extracellulare. L’effetto potrebbe concorrere a determinare l’adattamento delle membrane eccitabili a stimoli prolungati (riduzione nel tempo della frequenza di scarica dei pda ad uno stimolo costante). Probabilmente l’inattivazione “di tipo C” è dovuta al movimento voltaggio-dipendente della porzione esterna del segmento S6, che restringe il filtro di selettività. (Vedi canali del K+) Slow inactivation is a separate process that does not involve the III-IV linker inactivation particle. One hypothesis to explain slow inactivation is that it results from a structural rearrangement of the pore, similar to the mechanism for C-type inactivation in potassium channels [16]. However, the data that concern this hypothesis are conflicting. Ong et al. [17] demonstrated that long depolarizations that resulted in slow inactivation decreased the accessibility of an engineered cysteine residue in the pore region of domain III, consistent with a rearrangement of the pore. In contrast, Struyk and Cannon [18] observed no changes in the modification rates of engineered cysteine residues in the pore regions of the four domains after slow inactivation, indicating that the cysteines were equally accessible to the modification reagent before and after slow inactivation. These results suggest that the mouth of the pore does not close during slow inactivation.

Window Current 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -80 -60 -40 -20 20 Attivazione/inattivazione Potenziale di membrana (mV) Attivazione spostata verso potenziali più positivi, nessuna window 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Attivazione/inattivazione -80 -60 -40 -20 20 Potenziale di membrana (mV) window inattivazione attivazione attivazione3 Window current: Small range of voltages where VG Na channels (or other VG channels, like Ca2+ T-type) can open, but do not inactivate completely. This can be visualized by the superimposition of steady-state activation and inactivation curves. The voltage range determined by the crossing of these two curves is associated with a sustained current. So, although voltage-gated channels are thought to inactivate (for example, T-channels and some Na Channels generate transient currents), a sustained current could be generated by this window current only if the membrane potential is close to the voltage range defined above.

Correnti di sodio Transiente, INaF Persistente, INaP Risorgente Responsabile del potenziale d’azione Bloccata dalla TTX Persistente, INaP Cinetica Non inattiva Soglia di attivazione prossima al potenziale di riposo Risorgente Responsabile di attività autoritmica?

La corrente di Na persistente (INap) è una corrente che non inattiva Nel sistema nervoso periferico (motoneuroni) la INap è TTX-resistente. Invece nel SNC INap è TTX-sensibile

gNap aiuta a raggiungere la soglia Caratteristiche dell’INap: Soglia di attivazione ~-65 mV  è al di sotto del livello soglia per attivare i normali canali del Na inattivanti e quindi per generare un PdA  Proprio per questo tale corrente (non inattivante) è in grado di aumentare o favorire la risposta di un neurone ad uno stimolo depolarizzante (PPSE) sebbene sotto soglia Analogamente, uno stimolo iperpolarizzante (PPSI) può causare deattivazione della INap che a sua volta determinerà (indirettamente) una iperpolarizzazione più marcata 10 nA gNap= 2 mS gNap aiuta a raggiungere la soglia soglia gNap= 0 10 nA 1.5 s soglia

Spikes semplici generati in cellule del Purkinje Molte fibre parallele (~200,000) prendono contatto con una singola cellula del Purkinje (convergenza). La scarica generata è di tipo tonico (spikes semplici o regular spiking) e si sovrappone ad una attività spontanea basale. Le cellule di Purkinje generano potenziali d’azione spontanei anche in assenza di inputs sinaptici. La frequenza media durante la veglia è di circa 40 Hz (40 spikes per sec). La frequenza può aumentare per stimolazione delle fibre parallele. I treni in figura mostrano una scarica di spikes semplici. Spikes semplici: si ripetono a frequenze comprese tra i 17 e i 150 Hz (Raman and Bean, 1999). Possono originare spontaneamente (vedi correnti di Na risorgenti) nelle cellule del Purkinje (PC), oppure quando le PC sono attivate sinapticamente dalle fibre parallele. Raman e Bean (1998) hanno ipotizzato che canali del Na che generano una corrente transiente e risorgente attivano e inattivano in depolarizzazione, così come i canali del Na convenzionali, ma, al contrario di quelli convenzionali, essi possono riaprirsi durante il recovery dall’inattivazione. Questa riapertura avviene specificatamente durante una rapida fase di recovery a potenziali moderatamente negativi (>-70mV) e permette ai canali di riattivarsi fornendo la depolarizzazione rigenerativa per lo spike successivo (pre-potenziale). Purkinje cells show spontaneous electrophysiological activity in the form of trains of spikes both sodium-dependent and calcium-dependent. This was initially shown by Rodolfo Llinas (Llinas and Hess (1977) and Llinas and Sugimori (1980). P-type calcium channels were named after Purkinje cells, where they were initially encountered (Llinas et al. 1989), which are crucial in cerebellar function. We now know that activation of the Purkinje cell by climbing fibers can shift its activity from a quiet state to a spontaneously active state and vice-versa, serving as a kind of toggle switch (Loewenstein et al., 2005, Nature Neuroscience). However, these findings have recently been challenged by a study suggesting that such toggling by climbing-fiber inputs occurs predominantly in anaesthetized animals and that Purkinje cells in awake behaving animals, in general, operate almost continuously in the upstate (Schonewille et al., 2006, Nature Neuroscience).

Possibile origine dell’attività autoritmica degli spikes semplici Comportamento inusuale delle correnti di Na+ in un neurone del Purkinje del cervelletto dopo una forte depolarizzazione: Correnti di Na+ risorgenti Da un punto di vista meccanicistico la corrente risorgente potrebbe rappresentare un recupero dall’inattivazione che procede attraverso stati aperti del canale.(Raman & Bean, 1997). Nei neuroni del Purkinje i canali del Na+ che danno luogo a correnti risorgenti potrebbero coesistere con canali del Na+ convenzionali. Entrambi sono sensibili alla TTX. La comparazione tra le PC e neuroni in CA3 (ippocampo) suggerisce che la corrente risorgente è associata ad un inusuale e rapido (seppure parziale) recupero dall’inattivazione a potenziali vicini a -40 mV. Il parziale recupero dall’inattivazione a potenziali relativamente poco negativi è probabilmente alla base della capacità di generale potenziali d’azione conglomerati. Con i canali del Na convenzionali, come quelli dei neuroni in CA3, nessun recupero dall’inattivazione è possibile in 10-15 ms a -40 mV, cosicchè la cellula sarebbe completamente refrattaria durante una ripolarizzazione a quel potenziale. Nella PC, il rapido recupero dall’inattivazione dei canali del Na a quei potenziali renderebbe i canali disponibili all’insorgenza di un secondo spike. Perfino una disponibilità del solo 20% della corrente di Na massima durante l’intervallo tra gli spikes sarebbe più che sufficiente a generare un robusto secondo spike. Un modello per la corrente di Na+ risorgente. C1 - C5 denotano stati chiusi sequenziali e O denota lo stato aperto. I1 - I6 denotano gli stati inattivati per il normale meccanismo di inattivazione. OB denota lo stato in cui il canale entra con il secondo meccanismo di inattivazione, che è ipotizzato essere equivalente ad un blocco del canale aperto. Firing spontaneo in un neurone del Purkinje generato dalla presenza di correnti di Na+ risorgenti