Parte 10 Test di parentela e di paternità Genetica Forense (6 CFU) – Fulvio Cruciani Laurea Triennale in Scienze Biologiche Sapienza Università di Roma

Test di parentela e paternità

Test di parentela e paternità L’analisi del DNA può essere usata per studi sulla parentela di individui diversi. La maggior parte di questi studi riguarda: Test di paternità Studi per determinare se determinati individui (viventi o deceduti) siano imparentati. Analisi volte a risolvere casi di persone scomparse. Analisi volte ad identificare cadaveri nei disastri di massa Analisi di supporto ad investigazioni criminali (…il parente dell’assassino…) Predizione dell’origine etnica di un DNA (estendendo il concetto di parentela a quello di «coancestry»)

Test di parentela e paternità In tutti i casi, i test di parentela si basano su un concetto semplice: Individui imparentati condividono alleli in una maggiore proporzione (spesso misurabile) rispetto ad individui presi a caso dalla popolazione. Sono, in altre parole, più simili geneticamente

Test di parentela e paternità

Due possibili risultati: Test di paternità Due possibili risultati: (1) Compatibilità: Tutti* gli “alleli obbligati paterni” del figlio sono presenti nel padre putativo (2) Esclusione: Più* “alleli obbligati paterni” del figlio non sono presenti nel genotipo del padre putativo * Attenzione ad alleli nulli e mutazioni!!!

Allele obbligato paterno L’allele (i) che il padre DEVE avere Test di paternità Allele obbligato paterno L’allele (i) che il padre DEVE avere In base alle leggi dell’ereditarietà (1° legge Mendel ), considerando un locus autosomico e assumendo che “la madre sia certa”, se si conosce il genotipo di madre e figlio, è possibile dedurre (nella maggior parte dei casi) l’allele di origine paterna. Oppure (nei casi meno fortunati) due alleli di cui uno sia di origine paterna. Questo allele (o alleli) deve essere presente nel padre putativo (allele obbligato) pena esclusione della paternità.

Allele obbligato paterno Test di paternità Allele obbligato paterno

In caso di esclusione, il test può considerarsi concluso Test di paternità In caso di esclusione, il test può considerarsi concluso In caso di compatibilità, è necessario quantificare il “peso” dell’osservazione. P.I. = Indice di paternità (per un locus) C.P.I. = Indice di paternità combinato (considerando più loci).

Test di paternità Indice di paternità L’ indice di paternità (PI) si calcola attraverso il rapporto di due probabilità (che chiamiamo X e Y): PI = X/Y Numeratore (X): probabilità che il padre putativo trasmetta l’allele(i) obbligato essendo il vero padre. Il trio in analisi è un vero trio Denominatore (Y): probabilità che un uomo qualsiasi della popolazione trasmetta l’allele(i). Il trio in analisi è un falso trio Queste due probabilità discendono rispettivamente dalle leggi di Mendel e dalle leggi della genetica di popolazioni, il loro rapporto (PI, paternity index) esprime una verosimiglianza (Likelihood Ratio, LR)

Esercitarsi nel calcolo! Test di paternità Indice di paternità: Esercitarsi nel calcolo! Esempio (semplice): Padre putativo AC, Madre AB, Figlio AC, Individuare l’allele/i paterno obbligato/i (allele C in questo esempio) Numeratore: Probabilità che il padre trasmetta l’allele obbligato = ½ (Mendel!!) Denominatore: Probabilità che un individuo a caso della popolazione trasmetta l’allele obbligato = Frequenza dell’allele nella popolazione (Hardy-Weinberg!!)*  necessità di utilizzare database di frequenze alleliche. Se l’allele C ha frequenza nella popolazione (ad esempio) pC = 0,1, allora (in questo esempio): P.I. = 0,5/0,1 = 5 AC AB AC * Dimostrato alla lavagna

Esercitarsi nel calcolo! Test di paternità Indice di paternità: Esercitarsi nel calcolo! Frequenze nella popolazione: Fr(A) = p = 0.1 Fr(B) = q = 0.3 Fr(C) = r = 0.4 Fr (D) = s = 0.2 AA AB AA PI = 10

Esercitarsi nel calcolo! Test di paternità Indice di paternità: Esercitarsi nel calcolo! Frequenze nella popolazione: Fr(A) = p = 0.1 Fr(B) = q = 0.3 Fr(C) = r = 0.4 Fr (D) = s = 0.2 AA AB AB PI = 2.5

Esercitarsi nel calcolo! Test di paternità Indice di paternità: Esercitarsi nel calcolo! Frequenze nella popolazione: Fr(A) = p = 0.1 Fr(B) = q = 0.3 Fr(C) = r = 0.4 Fr (D) = s = 0.2 AB AC AC PI = 1

Esercitarsi nel calcolo! Test di paternità Indice di paternità: Esercitarsi nel calcolo! Frequenze nella popolazione: Fr(A) = p = 0.1 Fr(B) = q = 0.3 Fr(C) = r = 0.4 Fr (D) = s = 0.2 AB AB AB PI = 2.5

Test di paternità Calcolo dell’indice di paternità nell’ipotesi in cui il figlio sia omozigote per un allele P con frequenza allelica nella popolazione pari a fr(P) = p GC = genotype child GM = genotype mother GTM = genotype tested man (putative father)

Test di paternità Calcolo dell’indice di paternità nell’ipotesi in cui il figlio sia eterozigote per alleli P e Q con frequenza allelica nella popolazione pari a fr(P) = p; fr(Q) = q GC = genotype child GM = genotype mother GTM = genotype tested man (putative father)

Test di paternità Indice di paternità

Test di paternità Indice di paternità Un solo locus non è generalmente sufficiente per ottenere una informazione che abbia un peso rilevante circa la compatibilità osservata. Si considerano più loci C.P.I = Indice di paternità combinato Si ottiene come prodotto dei singoli P.I. (seconda legge di Mendel – regola statistica «del prodotto») Un valore di CPI > 100 viene in genere considerato sufficientemente alto da far ritenere il padre putativo il vero padre. CPI = 100 significa: « E’ 100 volte più probabile ottenere i risultati osservati (i profili genetici dei tre soggetti del trio) se il padre putativo (piuttosto che un uomo preso a caso dalla popolazione) è il vero padre Con i loci microsatelliti attualmente in uso in genetica forense, in caso di compatibilità si ottengono valori di CPI >> 100 CPI può essere trasformato in «probabilità di paternità» come CPI/(CPI+1)

Indice di paternità e probabilità di paternità Test di paternità Indice di paternità e probabilità di paternità In alternativa all’indice di paternità CPI può essere usata una probabilità di paternità La formula più utilizzata è la «probabilità di Essen-Möller» espressa come W = X/(X+Y) Esiste una relazione semplice tra CPI e W CPI = X/Y W = CPI/(CPI+1)* X: probabilità che il padre putativo trasmetta l’allele(i) obbligato essendo il vero padre. Y: probabilità che un uomo qualsiasi della popolazione trasmetta l’allele(i) obbligato. * Si ottiene dividendo per Y il numeratore ed il denominatore del W

Test di paternità in presenza di mutazioni In caso di esclusione di paternità si osserva generalmente non compatibilità per più loci. Ma come considerare una situazione in cui solo uno (o “pochi”) dei loci analizzati non sono compatibili? Bisogna tener conto del fatto che i microsatelliti presentano un tasso di mutazione elevato

Mutazione nei microsatelliti L’elevato tasso di mutazione nei microsatelliti è dovuto a scivolamento della polimerasi in replicazione Tasso di mutazione molto elevato: 10-2 – 10-4 mutazioni/STR/generazione La mutazione avviene generalmente per aumento o diminuzione di una singola unità ripetitiva Mutazioni per aumento più frequenti di mutazioni per diminuzione Il tasso di mutazione per ciascun microsatellite è positivamente correlato con la lunghezza dell’allele

Test di paternità in presenza di mutazioni

Test di paternità in presenza di mutazioni Una singola incompatibilità può essere anche determinata (meno frequentemente) da fattori diversi dalla mutazione in uno dei microsatelliti Alleli nulli nel padre Si verifica quando il padre è eterozigote per un allele convenzionale ed un allele nullo e trasmette l’allele nullo. L’allele nullo può essere dovuto a delezione di una regione che contiene lo STR, oppure, più frequentemente, a mutazioni in corrispondenza del sito di binding dei primers PCR che impediscono l’appaiamento o l’estensione ad opera della polimerasi

Test di paternità in presenza di mutazioni Determinare il peso statistico del CPI in presenza di mutazioni Se è sospettata una mutazione in un microsatellite, in una situazione in cui c’è compatibilità per tutti gli altri loci, è possibile computare il CPI semplicemente tenendo in considerazione che questo evento si verifichi Bisogna considerare quindi la probabilità che la mutazione avvenga, ovvero il tasso di mutazione del microsatellite per il quale questa è sospettata Nella sua formulazione più semplice, il PI per quel locus (che viene poi moltiplicato al PI degli altri loci per ottenere il CPI) sarà pari al tasso di mutazione stesso (indicato con m) PI = m Il valore di PI così ottenuto è molto conservativo, ma non del tutto corretto in quanto non tiene conto della probabilità alternativa (il denominatore del Likelihood Ratio, RL)

Test di paternità in presenza di mutazioni Determinare il peso statistico del CPI in presenza di mutazioni 𝑷𝑰= 𝝁 𝑷𝑬 PE è la probabilità di esclusione (la stessa probabilità vista nel caso delle misture) e corrisponde alla probabilità che un individuo preso a caso dalla popolazione sia escluso come potenziale padre del figlio nel trio (considerato anche il genotipo della madre), ovvero il cui genotipo non contenga alleli obbligati paterni

11,(null) 15,17 15,(null) Test di paternità Una singola incompatibilità può essere anche determinata (meno frequentemente) da fattori diversi dalla mutazione in uno dei microsatelliti Alleli nulli nel padre 11,(null) 15,17 15,(null)

(2) Disomia uniparentale materna nel figlio Test di paternità Una incompatibilità può essere anche determinata (meno frequentemente) da fattori diversi dalla mutazione in uno dei microsatelliti (2) Disomia uniparentale materna nel figlio Si ha disomia uniparentale quando un individuo eredita due cromosomi da un genitore e nessun cromosoma dall’altro. La disomia uniparentale può essere materna o paterna - Se interessa solo una porzione di cromosoma si chiama disomia uniparentale segmentale Se i due cromosomi sono uguali viene indicata come isodisomia Se i due cromosomi vengono da due diversi omologhi parentali si parla di eterodisomia Le disomie possono portare o meno a fenotipi patologici e in alcuni casi vengono scoperte casualmente mediante test di parentela

(2) Disomia uniparentale materna nel figlio Test di paternità Una incompatibilità può essere anche determinata (meno frequentemente) da fattori diversi dalla mutazione in uno dei microsatelliti (2) Disomia uniparentale materna nel figlio 15,17 11,12 11,11 15,17 11,12 11,12 ISOdisomia uniparentale materna ETEROdisomia uniparentale materna

(2) Disomia uniparentale materna nel figlio Test di paternità Incompatibilità può essere anche determinata (meno frequentemente) da fattori diversi dalla mutazione in uno dei microsatelliti (2) Disomia uniparentale materna nel figlio Nelle multiplex forensi alcuni STR sono localizzati sullo stesso cromosoma. In questi casi la disomia materna può portare a non compatibilità padre-figlio per più STR contemporaneamente

Incompatibilità può essere anche determinata (molto raramente) da Test di paternità Incompatibilità può essere anche determinata (molto raramente) da (3) Chimerismo paterno Nelle chimere coesistono due linee cellulari che differiscono per il loro patrimonio genetico. Mentre i mosaici (A) derivano da mutazioni post-zigotiche in un individuo derivato da un unico zigote, nelle chimere (B), le linee cellulari derivano da due «individui» diversi, o per fusione zigotica, o per fusione di cellule embrionali derivanti da due gemelli dizigotici.

CASE STUDY (7): Incompatibilità dovuta a chimerismo paterno US, 2014. Una coppia decide di ricorrere alla fecondazione assistita per avere un figlio. Alla nascita, il gruppo sanguigno del figlio risulta tuttavia incompatibile geneticamente con quello dei genitori. La coppia sospetta che siano stati utilizzati per errore degli spermatozoi di un altro donatore. Un test di paternità effettuato da un lab accreditato utilizzando cellule salivari esclude la paternità. Un test successivo, basato su numerosi SNPs dalla company «23andMe» esclude la paternità ma indica che il padre putativo sembrerebbe essere lo zio del neonato. Sulla base di questa informazione, un gruppo di ricercatori della Stanford University ipotizza e prova che il soggetto è una chimera tetragametica, derivata da fusione di due embrioni, in cui il patrimonio genetico di una parte delle cellule germinali deriva da uno zigote mentre altri tipi cellulari, tra cui le cellule salivari, derivano da un altro zigote. Casi analoghi hanno portato a famosi casi di chimerismo materno individuati tramite incompatibilità genetica madre-figlio. Esempio: https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa013452

Test di paternità in assenza di madre

Test di paternità in assenza di madre (test di paternità deficitario) In caso di assenza della madre è sempre possibile determinare quale sia (se il figlio è omozigote) o quali siano (se il figlio è eterozigote) gli alleli obbligati paterni. In caso di non paternità, sarà molto frequente ottenere un giudizio di esclusione In caso di compatibilità, il peso statistico sarà inferiore a quello osservato in caso di trio completo E’ ovviamente possibile calcolare un PI anche in questo caso, in modo analogo a quello visto per i casi non deficitari

quale marcatore? test di paternità distribuzione nel genoma: sufficiente che i geni non siano in LD per una più facile trattazione statistica: OK tutti i marcatori tasso di mutazione: non fondamentale ma da tenere in considerazione OK tutti i marcatori grado di eterozigosità: fondamentale, maggiore l’eterozigosità, maggiore l’informazione: OK minisatelliti, STR ereditarietà mendeliana: importante per una più facile trattazione statistica OK STR, SNPs tipizzazione mediante PCR: non rilevante se non in relazione ai costi possibilità di automazione su larga scala: non rilevante Nella pratica, per i test di paternità si utilizzano quasi esclusivamente STRs autosomici, con la possibilità di fare ricorso a STR –Y, mtDNA e STR-X in casi particolari

Test di parentela I test di parentela non sono limitati ai test di paternità, ma in alcuni casi può essere interessante ottenere informazioni che interessano altri tipi di parentela. In questi casi, è di fondamentale importanza interrogarsi su quale sia il grado di «somiglianza» genetica atteso tra diversi tipi di parenti, che può essere ricostruito tenendo in considerazione semplicemente le leggi di Mendel.

Test di parentela P 1,0 0,5 0,25 0,125 0,0625 Il coefficiente di parentela (P) indica la proporzione di alleli condivisi per discesa da due individui. PSI (Proportion of shared alleles) come misura grezza del grado di parentela…

Test di parentela Analogamente a quanto avviene per il test di paternità, i test di parentela vengono effettuati confrontando i due profili di STR ed utilizzando, come per il Paternity Index, un rapporto di due probabilità (LR, Likelihood Ratio) - Al numeratore la probabilità di osservare quei profili sotto l’ipotesi che due individui abbiano un determinato tipo di parentela - Al denominatore la probabilità di osservare quegli stessi profili sotto l’ipotesi che i due individui siano tra loro non imparentati

Test di parentela Profili generati con la multiplex Identifiler, che comprende 15 STR autosomici. Vengono indicati i LR ottenuti confrontando l’individuo 3 con i suoi 6 figli ed i suoi 6 fratelli. Si noti: I valori di CPI sono più elevati rispetto a quelli CSI Sia tra i test di paternità che di fratellanza c’è una grande diversità nei risultati.

Test di parentela Fratelli: LR =6.7 x 1011 Padre - Figlio: LR =7.8 x 107 Fratelli: LR =1.2 x 106 Padre - Figlio: LR =6.6 x 106

Test di parentela Si noti come il calcolo di LR nei test di parentela tra parenti (con l’esclusione delle relazioni genitori figli) può facilmente condurre a falsi positivi e falsi negativi, in misura tanto maggiore quanto più è basso il coefficiente di parentela (e quanto minore è il numero dei loci analizzati).

CASE STUDY (7): Il caso dei ladri gemelli Berlino, gennaio 2009, tre ladri mascherati vengono ripresi dalle telecamere di sicurezza mentre si calano dal lucernario dello Store Kaufhaus des Westens e rubano 6.8 milioni in gioielli. Il profilo genetico ottenuto dal DNA rinvenuto su un guanto usato durante il furto corrisponde a due persone diverse: due gemelli noti alla polizia per precedenti di furto e truffa. La polizia arresta i fratelli l’ 11 febbraio con l’accusa di furto con scasso, un reato che comporta una pena detentiva potenziale di 10 anni. Ma il 18 marzo, prima che il caso venisse presentato in processo, i due fratelli vengono entrambi rilasciati in quanto non era possibile in base all’analisi genetica stabilire quale dei due fosse coinvolto nel furto.

Identificazione di persone scomparse Test di parentela Identificazione di persone scomparse Per l’identificazione di persone scomparse, il profilo di DNA Q (ad esempio un profilo ottenuto a partire da resti umani non identificati) può essere confrontato con il profilo di DNA del soggetto scomparso, ottenuto da effetti personali (spazzolino da denti, pettine, vestiti, vecchi reperti medici come biopsie). In alternativa, il profilo Q può essere confrontato con quello ottenuto da parenti del soggetto scomparso. In questo caso, le informazioni sono ovviamente più «pesanti» se il confronto avviene con i parenti primi della persona scomparsa (ma genitori > fratelli). In questo tipo di indagini, si utilizzano frequentemente: (a) database di profili di DNA di persone scomparse (MP); (b) database di profili di resti umani non identificati (UHR); (c) database di profili di parenti di persone scomparse.

Identificazione delle vittime dei disastri di massa (DVI) Test di parentela Identificazione delle vittime dei disastri di massa (DVI) Il problema è in parte analogo a quello relativo all’identificazione di persone scomparse. In questo caso i resti da «identificare» appartengono spesso ad un numero definito (relativamente piccolo) di persone per le quali spesso si conosce una lista di nominativi. Anche in questo caso il profilo di riferimento può essere ottenuto in diversi modi: da campioni provenienti dall’individuo vittima del disastro da parenti delle persone in lista che possono essere utilizzati per “ricostruire” il genotipo della vittima. Problemi: In alcuni casi frammentazione e dispersione dei reperti: è necessario uno step di «riassociazione» basato sui profili genetici dei singoli reperti Spesso DNA fortemente degradato a causa di incendi o avverse condizioni ambientali Rispetto all’identificazione di persone scomparse, essendo limitato il numero di persone cui possono appartenere i resti, è possibile utilizzare sistemi polimorfici meno informativi

CASE STUDY (8): Identificazione delle persone disperse nel World trade center (NYC) in seguito all’attacco terroristico del 11/9 Sono stati generati 52,000 profili STR 44,000 profili mtDNA 17,000 profili SNPs 850 delle 1594 vittime identificate grazie all’analisi del DNA

Test di parentela: altre utilizzazioni Il ricongiungimento di un cittadino con i propri familiari residenti all’estero può essere in alcuni stati subordinato alla effettuazione di test genetici di parentela. Spesso i test di parentela possono essere d’aiuto nelle indagini criminali, permettendo, attraverso il tracciamento di relazioni di parentela, l’identificazione di individui che hanno commesso dei reati. Un caso da manuale, che ha coinvolto test di parentela multipli e di diverso tipo, è quello relativo al caso Gambirasio (il caso viene discusso a lezione, si legga a proposito la parte relativa alle indagini genetiche contenute nel documento pubblico ordinanza numero 6056/2014 – Tribunale di Bergamo).