La secrezione

ESOCITOSI Le cellule espellono prodotti di scarto o particolari prodotti di secrezione mediante la fusione di vescicole con la membrana plasmatica. L’esocitosi determina l’incorporazione della membrana della vescicola secretoria nella membrana plasmatica. Questo costituisce un meccanismo primario di accrescimento della membrana plasmatica.

SECREZIONE COSTITUTIVA SECREZIONE DI PROTEINE lipide di membrana proteina solubile SECREZIONE COSTITUTIVA proteina di membrana segnale TGN SECREZIONE REGOLATA

SECREZIONE DI PROTEINE COSTITUTIVA REGOLATA le vescicole prima di essere rilasciate definitivamente, attendono una ulteriore segnalazione una volta formatasi la vescicola viene immediatamente rilasciata dalla membrana che l'ha originata per fondersi con la membrana citoplasmatica per l'espulsione. tutte le cellule continua non accumulo di vescicole vescicole a vita breve stimolo non necessario non concentrazione cellule specializzate discontinua accumulo di vescicole vescicole a vita lunga stimolo necessario concentrazione

I GRANULI DI SECREZIONE MATURANO

ALCUNE PROTEINE, NEL CORSO DELLA SECREZIONE, TAGLIO PROTEOLITICO ALCUNE PROTEINE, NEL CORSO DELLA SECREZIONE, SUBISCONO UN TAGLIO PROTEOLITICO. pro-opiocortina Perché? Alcuni peptidi nella loro forma finale sarebbero troppo piccoli per la traduzione nel RER e per subire altre trasformazioni (i.e glicosilazione)

E’ POSSIBILE OSSERVARE IN VITRO IL MOVIMENTO DELLE VESCICOLE? LE VESCICOLE SI MUOVONO LUNGO MICROTUBULI!

COME FUNZIONANO I MOTORI MOLECOLARI?

*Dove vanno le vescicole ? MEMBRANA ER GOLGI LISOSOMI NUCLEO SNARE RAB GTPase

Come viene attivata RAB GTPasi?

DOVE SONO LOCALIZZATE LE Rab ?

Rab 27 Rab 3 Rab 8 Regolano la secrezione

TETHERING Attracco ancoraggio 3-Proteine coleid-coil Il termine tethering factors indica un gruppo eterogeneo di proteine cellulari responsabile del legame iniziale delle vescicole di trasporto con le membrane bersaglio prima della loro fusione. Fino a poco tempo fa i tethering factors venivano divisi in due classi: complessi multi-subunità e coleid-coil proteine. Attualmente sono state individuate tre differenti classi funzionali: 1-Complessi oligomerici che legano le SNARE e che tipicamente agiscono come effettori RAB ( DCGE ) 2-Complessi oligomerici che funzionano come fattori di scambio guanina-nucleotide per le RAB (GEF) 3-Proteine coleid-coil Attracco ancoraggio

Le vescicole che gemmano dal RE perdono parzialmente il loro rivestimento e si muovono rapidamente lungo i microtubuli fino a raggiungere il comparto di Golgi. Qui avviene l’attracco, l’ancoraggio e la fusione tra le vescicole e la membrana ricevente, grazie all’intervento di proteine RAB, SNARES, e TF.

Rab6 (blue) and Arl1 (gray) cooperate to bind GCC185 (green), a vesicle- transporting tether. GM130 and/or Giantin binding may trigger a conformation change in p115, revealing a Rab1 binding site.

Attracco ancoraggio fusione

ancoraggio

FUSIONE

KISS AND RUN

SEGNALI DI INDIRIZZO DI PROTEINE ALLA VIA SECRETORIA COSTITUTIVA REGOLATA Aggregazione: pH e Ca++ Ponte disolfuro: CgB, POMC Sito di taglio di proteasi: Prorenina Carbossipeptidasi E: Proinsulina and Proencefalina Carbossi terminale: PC2 Nessun segnale

POLARITA’ IN CELLULE EPITELIALI MEMBRANA APICALE BASOLATERALE GIUNZIONE TIGHT

POLARITA’ IN CELLULE EPITELIALI E NERVOSE ASSONE APICE BASE DENDRITI

MEMBRANA APICALE VESCICOLE GOLGI VESCICOLE RER MEMBRANA BASOLATERALE

SEGNALI DI INDIRIZZO POLARIZZATO IN CELLULE EPITELIALI sequenze citosoliche domini transmembrana ancora GPI? zuccheri (N o O) Ap sequenze citosoliche simili o meno a segnali di endocitosi Bl

SORTING DIRETTO SORTING INDIRETTO endosomi basolaterali vescicole apicali SORTING DIRETTO SORTING INDIRETTO

TGN trasporto endocitosi budding loading esocitosi

Endocitosi

… e non dimentichiamo i virus!!!!!

VI SONO DIFFERENTI TIPI DI ENDOCITOSI TIPO DI MATERIALE INTERNALIZZATO FAGOCITOSI PINOCITOSI (micro-macro) TIPO DI VESCICOLA CHE SI FORMA ENDOCITOSI MEDIATA DA CAVEOLE (caveolina) ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORE (clatrina)

PINOCITOSI batterio fagosoma FAGOCITOSI endosoma precoce endosoma tardivo LISOSOMI reticolo endoplasmico mitocondrio autofagosoma AUTOFAGIA

FAGOCITOSI batterio pseudopodo membrana plasmatica

Figure 13-47b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

ENDOCITOSI MEDIATA DA CAVEOLINA E CLATRINA

LA CLATRINA PROMUOVE LA FORMAZIONE DI VESCICOLE DI ENDOCITOSI ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORE MOVIE

IL RIVESTIMENTO DI CLATRINA HA UNA PRECISA ORGANIZZAZIONE GEOMETRICA

LE PROTEINE Rab5 E Rab7 REGOLANO L’ENDOCITOSI

TAPPE DI ENDOCITOSI MEMBRANA PLASMATICA ENDOSOMI PRECOCI MICROTUBULI CORPO MULTIVESCICOLARE ENDOSOMI TARDIVI TGN LISOSOMI

LE PROTEINE Rab HANNO MOLTI INTERATTORI

Figure 13-15 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

INOSITOLO, INOSITOLI FOSFATO ED IDENTITA’ DEI COMPARTIMENTI Gli inositolo fosfolipidi sono solo il 10% dei FL di membrana, ma hanno importanti funzioni di regolazione. Possono subire cicli di fosforilazione e defosforilazione dell’inositolo nelle posizione 3’,4’ e 5’ producendo tipi diversi di fosfoinositidi (PIP). La conversione di PI e PIP è altamente Compartimentalizzata Organelli e sia nella via biosintetica che secretoria contengono chinasi specifiche per PI e PIP Fosfatasi specifiche per PIP

DIVERSI TIPI DI FOSFATIDIL-INOSITOLO FOSFATO SONO GENERATI SULLA MEMBRANA Figure 13-10 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

DIVERSI TIPI DI FOSFATIDIL-INOSITOLO FOSFATO SONO PRESENTI SU DIFFERENTI DOMINI DI MEMBRANA Figure 13-11 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

1. INTERAZIONE LIGANDO-RECETTORE 2. LEGAME DELL’ADAPTINA AL RECETTORE TAPPE DELLA ENDOCITOSI MEDIATA DA RECETTORE 1. INTERAZIONE LIGANDO-RECETTORE 2. LEGAME DELL’ADAPTINA AL RECETTORE 3. FORMAZIONE DEL COAT DI CLATRINA 4. INVAGINAZIONE DELLA MEMBRANA 5. FISSIONE 6. PERDITA DEL COAT DI CLATRINA 7. FUSIONE CON ENDOSOMI PRECOCI 8. ACIDIFICAZIONE 9. DISTACCO LIGANDO-RECETTORE 10. FORMAZIONE DI ENDOSOMI TARDIVI 11. TRASPORTO AI LISOSOMI E/O GOLGI (O RICICLO O TRANSCITOSI)

INDIRIZZI DELLA ENDOCITOSI

ESEMPI DI ENDOCITOSI DI: 1 LDL 2 TRANSFERRINA 3 VIRUS 4 EGF 5 Ig POLIMERICHE

LE LDL TRASPORTANO COLESTEROLO 1 LE LDL TRASPORTANO COLESTEROLO Proteina Apo-B fosfolipidi colesterolo esteri del colesterolo

A coat di clatrina LDL recettori di LDL B recettori mutati

ENDOCITOSI DI LDL LDL recettori LDL endosoma enzimi colesterolo lisosoma

ENDOCITOSI DI LDL

A coat di clatrina LDL recettori di LDL B recettori mutati

2 LA TRANSFERRINA LEGA IL FERRO Fe Fe

ENDOCITOSI DELLA TRANSFERRINA recettori Fe Fe Fe Fe Fe Fe endosoma Fe Fe Fe Fe Fe Fe Fe Fe Fe Fe Fe transferrina enzimi lisosoma

L’ENDOCITOSI DELL’EGF SI REALIZZA TRAMITE IL SUO RECETTORE 4 L’ENDOCITOSI DELL’EGF SI REALIZZA TRAMITE IL SUO RECETTORE

IMPORTANZA DELLA UBIQUITINAZIONE Nell’endocitosi mediata da recettore I recettori vengono modificati dall’aggiunta di molecole di ubiquitina che servono a guidarli nel loro destino finale

Figure 13-58 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Receptor-mediated endocytosis

non solo clatrina

Le Membrane cellulari: Zone specializzate Domini raft e caveole La membrana plasmatica Regione non specializzata i microdomini raft, regioni in cui predominano alcuni lipidi In alcune zone della membrana, esistono delle regioni, le caveole (invaginazioni delle membrane plasmatiche) caratterizzate dalla presenza di proteine denominate caveoline E’ ormai accertato che nelle membrane esistono delle zone specializzate, dei microdomini, chiamati raft, in cui predominano alcuni lipidi. Queste zone sono caratterizzate dal non essere solubilizzate da detergenti non-ionici, tanto è vero che hanno acronimi diversi come DRMs (detergent-resistant membranes) and Digs (detergent-insoluble glycolipid-enriched membrane domains. In alcune zone della membrana, esistono delle regioni le caveole, che sono zone morfologicamente distinguibili come invaginazioni delle membrane plasmatiche, caratterizzate dalla presenza di proteine denominate caveoline. Una delle ragioni per le quali queste regioni della membrana sono attualmente oggetto di studio è che queste possano essere coinvolte nei meccanismi di trasduzione del segnale. Queste regioni sono ricche di glicosfingolipidi, colesterolo e di proteine che non hanno una forma particolare. La loro dimensione è compresa tra 70 e 300 nm. Oltre a queste molecole nel monostrato esterno sono presenti proteine ancorate al fosfatidil-inositolo. Nel monostrato interno sono invece localizzate proteine tipo Ras, coinvolte nella trasduzione del segnale. Ciò rafforza il concetto che i domini RAFT agiscano come piattaforma per concentrare molecole segnale in una regione particolare della membrana e anche per raggruppare specifiche proteine ancorate al fosfatidil-inositolo. Questi raft non rimangono stazionari nella membrana, ma si muovono lateralmente, e la loro mobilità è fortemente infuenzata dal contenuto di colesterolo della membrana. In particolare la riduzione del colesterolo riduce la mobilità dei raft. Le caveole sono caratterizzate dalla loro associazione con le caveoline. Queste proteine interagiscono con parecchie molecole segnale nella membrana e costituiscono l’impalcatura per organizzare i preassemblati complessi della segnalazione. Differenti molecole segnalanti sono associate a Digs e caveole. Digs si associano a Ras e molecole correlate a Ras. Domini ricchi di caveoline contengono src, proteine G, protein chinasi C e RhoA. I lipidi di membrana possono assumere anche delle configurazioni non-lamellari. Questo determina una regione micellare nel piano trasversale della membrana che aumenta lo spessore locale e la curvatura della membrana, in relazione alla morfologia piatta e planare del resto della membrana. L’organizzazione biochimico e fisica dei non-bilayer lipid è differente dagli altri lipidi, in particolare per la grandezza della loro testa polare e delle loro catena acilica. Generalmente, in regioni non a doppio strato, molecole lipidiche con una testa polare più piccola e catene alifatiche più lunghe (fosfatidil-etanolammina) sono impaccate densamente sul piano laterale, determinando un incremento della curvatura su uno o su entrambi gli strati. Questa alterazione nel doppio strato lipidico esercita una pressione laterale o stress di curvatura, sulle proteine presenti in quella zona, che è stato dimostrato essere essenziale per il funzionamento della batteriorodopsina e della protein chinasi C. Infatti fosfatidiletanolammnina è stata rinvenuta in strutture cristalline di diverse proteine di membrana. le caveoline interagiscono con molecole segnale e costituiscono l’impalcatura per organizzare i preassemblati complessi della segnalazione (Ras, src, proteine G, PKC e RhoA.

La membrana plasmatica apicale di molte cellule è enormemente arricchita di glicosfingolipidi che aiutano a proteggere questa superficie esposta dal danno ad esempio provocato dagli enzimi digestivi e pH acido in siti come lo stomaco o il lume dell’intestino. Anche proteine della membrana plasmatica che sono legate al bilayer lipidico da un àncora di glicosilfosfatidilinositolo (GPI), si trovano esclusivamente nella membrana plasmatica apicale. Lipid raft La membrana plasmatica contiene “rafts lipidici” arricchiti in sfingolipidi, colesterolo ed alcune proteine di membrana. Rafts lipidici pottrebbero mediare lo smistamento (“sorting”) di glicosfingolipidi e proteine ancorate mediante GPI alla membrana plasmatica apicale

Le caveole (prendono il nome dalla proteina che le origina, la caveolina) sono microdomini presenti nelle membrane biologiche caratterizzati da una peculiare composizione lipidica. In particolare sono ricchi in colesterolo e sfingolipidi. Rappresentano delle frazioni di membrana importanti nella generazione e modulazione dei segnali intracellulari. Le caratterizzazione delle caveole (conosciute anche con il nome di rafts) avviene mediante anticorpi specifici, come quelli diretti contro caveolina-1, tipico marcatore di queste ultrastrutture. Permettono l'attraversamento delle membrane capillari a molecole specifiche (anticorpi, fattori del complemento, fattori della coagulazione), che non sono in grado di attraversarle in altro modo (ad esempio per filtrazione o diffusione).

Il trasporto del colesterolo Cholesterol is synthesized in the liver and is ingested in food. To get into cells, cholesterol which is insoluble in water (the aqueous phase of blood), must be transported by carriers. LDL (low-density lipoprotein) particles serve this function as transport vesicles for cells.

Il trasporto del Ferro

5 TRANSCITOSI

Transcitosi delle IgG materne attraverso le cellule 5 Transcitosi delle IgG materne attraverso le cellule epiteliali dell’intestino di topi neonati

Figure 13-61 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

membrana apicale endosoma apicale endosoma basolaterale membrana basolaterale

TRAFFICO VESCICOLE FUSIONE LIPIDI DI MEMBRANA VIRUS