Transporto di Molecole tra Nucleo e Cytosol

Membrana Nucleare >Due membrane concentriche          Membrana –esterna in continuità con ER          Membrana interna contiene proteine che agiscono come           siti di legame per la cromatina e lamina nucleare >Perforata da pori nucleari per     importazione ed esportazione selettiva

La lamina nucleare sta alla base della membrana nucleare La lamina nucleare è costituita da proteine filamenti intermedi chiamate lamine. La lamina nucleare si trova sotto la membrana nucleare interna e Esse sono fisicamente collegati da proteine integrali di membrana a cui si lega la lamina La lamina nucleare fornisce supporto fisico per l'involucro nucleare.

La lamina nucleare gioca un ruolo chiave nell’assemblaggio e disassemblaggio della membrana nucleare in mitosi Lamina La lamina perde la capacità di strutturarsi quando viene fosforilata.

Proteine della INM Sono coinvolte nell’organizzazione della cromatina nel nucleo Proteine dell’ONM In continuità anche con proteine INM colelgano il nucleo al citoscheletro

The Nuclear Pore Complex NPC: all traffic between nucleus & cytoplasm in higher eukaryotes occurs via NPC (exception: mitosis) Cytoplasmic filament Ribosome ~150Å ~2000Å Cytoplasmic ring Cytoplasm Nucleus Inner ring Basket Distal ring

Transporto di Molecole tra Nucleo e Cytosol Complesso del poro nucleare >massa di 125 milioni KD; >~ 50 proteine diverse disposti in ottagono >Tipico cellule di mammifero 3000-4000

Residui fenilalanina-glicina giocano un ruolo chiave nel trasporto nucleare

Transport of Molecules Btwn Nucleus and Cytosol Attraverso il canale acquoso del poro possono facilmente passare piccole molecole<5.000; Molecole> 60.000 non passano Funzioni ~ diaframma Proteine recettori trasportano attivamente Molecole attraverso poro nucleare

Nuclear Localization Signal Generalmente composto da due brevi sequenze ricche di + aa lys & arg Può essere posizionato ovunque Pensato per formare loop o macchie sulla superficie proteica Gli NLS non vengono rimossi dopo il trasporto Trasporti attraverso pori acquosi non proteine translocatori Trasportano proteine ripiegate Il processo richiede energia

LA NUCLEOPLASMINA E’ UNA PROTEINA CHE SI LOCALIZZA NEL NUCLEO  NUCLEOPLASMINA RADIOATTIVA  INIEZIONE NEL CITOPLASMA  LOCALIZZAZIONE NEL NUCLEO

LE TESTE DELLA NUCLEOPLASMINA NON SI LOCALIZZANO NEL NUCLEO RADIOATTIVE  INIEZIONE NEL CITOPLASMA LOCALIZZAZIONE NEL CITOPLASMA

LE CODE DELLA NUCLEOPLASMINA SI LOCALIZZANO NEL NUCLEO  LOCALIZZAZIONE NEL NUCLEO CODE RADIOATTIVE INIEZIONE NEL CITOPLASMA LE CODE DELLA NUCLEOPLASMINA SI LOCALIZZANO NEL NUCLEO

PARTICELLE DI ORO COLLOIDALE LEGATE ALLE CODE DI NUCLEOPLASMINA SI LOCALIZZANO NEL NUCLEO CODE LEGATE AD ORO COLLOIDALE  INIEZIONE NEL CITOPLASMA   LOCALIZZAZIONE NEL NUCLEO

LA SEQUENZA SEGNALE DELL’ANTIGENE T E’ STATA INDIVIDUATA MEDIANTE DELEZIONI N/C C N C

LA LISINA IN POSIZIONE 128 HA UN RUOLO CRITICO NELLA LOCALIZZAZIONE NUCLEARE DELL’ANTIGENE T SI LOCALIZZA NEL NUCLEO

LA DIMOSTRAZIONE CHE UNA SEQUENZA E’ UN SEGNALE PREVEDE ESPERIMENTI DI: 1. RIMOZIONE DELLA SEQUENZA 2. MUTAZIONE DELLA SEQUENZA 3. TRASFERIMENTO DELLA SEQUENZA SU UN’ALTRA PROTEINA

LE SEQUENZE SEGNALE DI LOCALIZZAZIONE NEL NUCLEO HANNO CARATTERISTICHE IN COMUNE PROTEINA ANTIGENE T (SV40) PROTEINA 72kDa (adenovirus) VP2/3 (polioma) 70kDa (drosophila) c-myc (pollo) SEQUENZA Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val Pro-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg Gln-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu Lys-Arg-Gly-Lys-Arg-Lys-Lys Glu-Gln-Lys-Arg-Arg-Arg-Arg

NUCLEAR LOCALIZATION SIGNALS LE SEQUENZE SEGNALE DI LOCALIZZAZIONE NEL NUCLEO HANNO CARATTERISTICHE IN COMUNE NLS NUCLEAR LOCALIZATION SIGNALS 1. SEQUENZE RICCHE IN AA BASICI PKKKRKV 2. ALL’INTERNO DELLA PROTEINA! 3. FREQUENTEMENTE BIPARTITE!!

The molecular machineries behind nuclear protein transport Nucleoporins (known as Nups): Make up the cytoplasmic filaments, nuclear basket, and line the pore Contain different types of FG (Phe/Gly) repeats Nuclear transport factors make multiple sequential contacts with distinct Nups, resulting in docking and translocation of nuclear transport complexes Exact mechanism by which Nups mediate translocation of complexes remains unclear. but may involve sequential association with of receptor plus cargo with FG repeats lining pore (Bayliss, R. et al. 2000)

Importo Nucleare - i giocatori Importine = proteina recettore citosolico lega a NLS di proteine "cargo" Nuclear Import Recettori = lega macromolecole essere esportati da nucleo Adattatori = talvolta necessarie a legare proteina bersaglio al recettore nucleare RAN-GTP

LA PROTEINA RAN E’ UN REGOLATORE CHIAVE DEL TRASPORTO DI PROTEINE NEL NUCLEO RAN GTP GAP GEF GTP hydrolysis activating protein guanine nucleotide exchange factor RAN GDP Nel citosol

Ran GTPase= molecular switch Drives directional transport in appropriate directin Conversion btwn GTP and GDP bound states mediated by Ran specific regulatory proteins GAP converts RNA-GTP to Ran-GDP via GTP hydrolysis GEF promotes exchg of GDP for GTP converting Ran-GDP to Ran-GTP Ran GAP in cytosol thus more Ran-GDP in cytosol Ran GEF in nucleus thus more Ran-GTP in nucleus

5.15 The Ran GTPase controls the direction of nuclear transport The Ran-GAP is cytoplasmic, whereas the Ran-GEF is located in the nucleus. Ran controls nuclear transport by binding karyopherins and affecting their ability to bind their cargoes.

RanGTP/GDP exchange: driving force behind cargo exchange A small GTPase that gives directionality to nuclear transport, see below Members of the Ras oncogene family (like Rab, which regulates vesicle fusion) Binds to nuclear transport receptors (Matsurra and Stewart, 2004)

How does the Ran GTPase cycle work? Ran GTPase has little hydrolysis or exchange activity on its own. Regulated by GTPase-activating protein (RanGAP) that promotes hydrolysis that is predominantly in cytoplasm and guanine exchange factor (RanGEF) that promotes GTP exchange that is predominantly in the nucleus Ran exists in inactive GDP-bound form in the cytoplasm In the nucleus, however, Ran is largely bound to GTP Ran gradient is critical for most nuclear transport, except bulk mRNA transport which is mediated by factors that are not karyopherins Ran gradient is created by having RanGAP (which promotes GTP hydrolysis) only in cytoplasm and RanGEF (which promotes loading of Ran with GTP) only in nucleus (Nalkieny and Dreyfus, 1999)

SI POSSONO INDIVIDUARE PIU’ TAPPE NEL TRASPORTO NUCLEARE 1. PROTEINE SOLUBILI (IMPORTINE) RICONOSCONO LE NLS 2. IL COMPLESSO IMPORTINE-PROTEINA NUCLEARE SI LEGA ALLE PROTEINE DEL PORO (NUP) (RIPETIZIONI FG) 3. IL PORO SI DILATA ED IL COMPLESSO LO ATTRAVERSA 4. L’IMPORTINA SI DISSOCIA DALLA PROTEINA NUCLEARE 5. L’IMPORTINA TORNA NEL CITOSOL

The nuclear import/export cycle 1. In the cytoplasm, NLS-containing cargo is bound by the heterodimeric import receptor (importin / (Lei and Silver, 2004)

The nuclear import/export cycle 2. Ran-GTP binds to importin, causing conformational change in the importin, which releases the cargo (Lei and Silver, 2004)

The nuclear import/export cycle 3. If cargo is phosphorylated, it can interact with exportins and Ran-GTP, allowing the complex to exit the nucleus (Lei and Silver, 2004)

The nuclear import/export cycle 3. In the cytoplasm, hydrolysis of Ran-GTP to Ran-GDP causes dissociation of the export complex (Lei and Silver, 2004)

Nuclear Export Works like import in reverse Export receptors bind export signals and nucleoporins to guide cargo thru pore Import and export receptors member of same gene family

Transport of Molecules Btwn Nucleus and Cytosol Regulation Afforded by Access to Transport Machinery Controlling rates of import and export determines steady state location phosphorylation/dephosphorylation of adjacent aa may be required for receptor binding Cytosolic anchor or mask proteins block interaction w/ receptors Protein made and stored in inactive form as ER transmembrane protein

LE SEQUENZE SEGNALE POSSONO ESSERE MASCHERATE

Control of mRNA Export Proteins w/ export signals loaded onto RNA during transcription and processing (RNP) Export signals guide RNA out of nucleus thru pores via exportin proteins than bind RNP Export mediated by transient binding to FG repeats Immature mRNAs retained by anchoring to transcription and splicing machinery Proteins disassociate in cytosol and return to nucleus

Transport of Molecules Btwn Nucleus and Cytosol Nuclear envelop disassembles during mitosis and reassembles when ER wraps around chromosomes and begins to Fuse