Il Cavallo Rosso E. Corti (Ed. ARES) Biotecnologie vegetali per l’industria e l’ambiente Biochimica classica - atto I Il Cavallo Rosso E. Corti (Ed. ARES)

Come manipolare il metabolismo? È necessaria la comprensione del sistema metabolico e di come venga modulato il flusso Metà corso dedicato alla comprensione dei sistemi multienzimatici Metà corso a discutere degli interventi di ingegneria metabolica

Il metabolismo: questo sconosciuto Un centinaio di anni di studio degli enzimi e dei metaboliti ci ha permesso di costruire accurate mappe metaboliche: E. Buchner: cell-free fermentation "Alcoholic Fermentation Without Yeast Cells". (1897) Ber. Dt. Chem. Ges. 30: 117–124. http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1907/buchner-lecture.pdf

Flux is phenotype! (H. Kacser) E’ possibile descrivere il metabolismo a partire dalle proprietà (studiate di solito in vitro) dei suoi componenti? vie metaboliche enzimologia Flux is phenotype! (H. Kacser) Teoria generale capace di predire i flussi?

Cinetica di MM irreversibile Breve ripasso di enzimologia Colmate le lacune con attenzione (ad es. Voet & Voet, Biochemistry) Cinetica di MM irreversibile E + S = ES  E + P Derivazione della formula reperibile su tutti i testi (decenti) di biochimica. Formula e curva sono la stessa cosa detta in due modi diversi!!!

Curva v/S Significato di KM e Vm; unità di misura

Molte rappresentazioni della cinetica sono sballate Quando v raggiunge Vmax? A [S] infinito, cioè mai! http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/asympt.htm

Linearizzazione y = 0 x = 0 Esistono tipi diversi di linearizzazione (vedi Voet e Voet o Fell)

Inibizione competitiva E + S = ES  E + P + I  Ki es. Succinato deidrogenasi: fumarato (S) e malonato (I) EI + S = EIS  no reaction Il valore di Km viene aumentato: KMapp = KM(1+I/Ki)= KMα L’inibizione si annulla aumentando la concentrazione del substrato Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?

Inibizione incompetitiva E + S = ES  E + P + I  Ki es. EPSP sintasi (con glifosate) EIS  no reaction Il valore di Vm viene diminuito: Vmapp= Vm/(1+I/Ki)= Vm/α’ L’inibizione, inefficace a basse [S], non si annulla ad alte [S] Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?

Fosfoenolpiruvato (PEP) 3-enolpiruvil-3-shikimato -fostato (EPSP) COO - -2 3 PO C 2 OOC N 2- Shikimato-3-fosfato Fosfoenolpiruvato (PEP) Glifosate 3-enolpiruvil-3-shikimato -fostato (EPSP) EPSP sintasi -2 O3 P Reazione della EPSP sintasi e sua inibizione da parte del glifosate Nonostante assomigli molto a parte dello shikimato, il glifosate è un inibitore competitivo del PEP. La reazione è sequenziale, con lo shikimato che entra per primo, per cui il glifosate risulta essere un inibitore incompetitivo di questo primo substrato. Questo causa l’accumulo di Shikimato e la riduzione in Arogenato (che è un inibitore della DHAP sintasi che quindi esacerba l’accumulo di Shikimato) (vedi note) http://plantandsoil.unl.edu/pages/informationmodule.php?idinformationmodule=959117477&topicorder=5&maxto=7&minto=1 http://plantandsoil.unl.edu/Image/siteImages/ShikimatePathway.gif

Inibizione mista E + S = ES  E + P + EI EIS  no reaction  Ki K’i EIS  no reaction EI Un caso particolare della Inibiz. Mista è quella non-competitiva dove alfa = alfa’ Quindi non c’è effetto sulla Km Sia Vm che Km cambiano: Vmapp = Vm/α′ e KM′ = α KM/α′ L’inibizione si sente sia a bassa che ad alta concentrazione di S Che faccia avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?

Le inibizioni dal punto di vista grafico

Equazione MM reversibile Per una dimostrazione elegante: http://www.bioinformaticsservices.com/bis/resources/cybertext/chapter6.html

Due conseguenze importanti: La v della reazione reversibile sarà minore di quella irreversibile per due motivi: L’equazione per la MM reversibile è derivabile come quella irreversibile La presenza di prodotto rende più piccolo il numeratore La presenza di prodotto rende più grande il denominatore

La relazione di Haldane All’equilibrio v = 0 per cui il numeratore sarà = 0 = Keq

Le costanti cinetiche non sono indipendenti! Ricordatevi che il valore della Keq è indipendente dalla presenza dell’enzima Una formulazione alternativa dell’equazione si ottiene sfruttando la relazione di Haldane (sostituisco Vr) Prendete l’equazione della MM rev e sostituite a Vr l’espressione sulla sinistra

Quando la Keq >>1 ) (cioè una reazione molto spostata verso i prodotti) ) L’effetto di P si fa sentire solo sul denominatore (si parla di inibizione da prodotto)

Inoltre se [P]/KP è bassa ( 0 o comunque <<1) Che altro non è se non l’equazione per la reazione irreveversibile

Importantissimo L’equazione di MM irreversibile non descrive il comportamento in vivo perché la maggior parte degli enzimi catalizzano reazioni reversibili. Quella reversibile è cruciale per descrivere i sistemi reali Inoltre la maggior parte delle reazioni enzimatiche hanno più di un substrato o di un prodotto per cui si richiedono equazioni più complesse.

Enzimi a più substrati/prodotti A + B  C + D Equaz. generale (irrev.) Classificati secondo il meccanismo: *Random order * Compulsory order * Ping Pong Sequenziali

http://employees. csbsju http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/transkinetics/ATCasekin.jpg Enzimi allosterici: Molti enzimi non hanno curve iperboliche, ma sigmoidi, per cui sono stati introdotte teorie per spiegare questi comportamente (Hill, MWC e Koshland) v =Vm*(x*(1+x)n-1+L*c*x*(1+c*x)n-1)/((1+x)n + L*(1+c*x)n) [MWC model] Andate a rivederli sul testo di biochimica !

atto II (ovverosia la termodinamica) Dopo le nozioni essenziali di enzimologia, ripassiamo alcuni concetti di termodinamica che sono rilevanti per le vie metaboliche

All’eq. G= 0 e G°' = –RT lnKeq Si raggiunge sempre uno stato stazionario (ss)? Che conseguenze avrebbe non raggiungere uno ss… La presenza di un flusso in una via metabolica cosa implica dal punto di vista termodinamico? Un G ≠ 0 (<0) G = G°' + RT lnQ Q = quoziente di reaz. Q (chiamato anche Γ) è il rapporto conc. dei prodotti/conc. reagenti All’eq. G= 0 e G°' = –RT lnKeq G°' = –RT lnKeq = –2.3RT Log10(Keq) G°' è la variazione di energia libera in condizioni standard

Ordine di grandezza Da Lehninger ATP + H2O  ADP + Pi Go' = -31 kJoules/mol Pi + glucose  glucose-6-P + H2O Go' = +14 kJoules/mol

Values of Go and Keq for common reactions at 25oC SO3(g)       2 SO2(g) + O2(g)   141.7 1.4 x 10-25 H2O(l) H+(aq) + OH-(aq) 79.9 1.0 x 10-14 AgCl(s) + H2O Ag+(aq) + Cl-(aq) 55.6 1.8 x 10-10 HOAc(aq) + H2O H+(aq) + OAc-(aq) 27.1 1.8 x 10-5 N2(g) + 3 H2(g) 2 NH3(g) -32.9 5.8 x 105 HCl(aq) + H2O H+(aq) + Cl-(aq) -34.2 1 x 106 Cu2+(aq) + 4 NH3(aq) Cu(NH3)42+(aq) -76.0 2.1 x 1013 Zn(s) + Cu2+(aq) Zn2+(aq) + Cu(s) -211.8 1.4 x 1037 Reaction Go(KJ/mol) Keq R = 8.314472[15] J · K-1 · mol-1 Go (kJ/mol)

Quoziente di reazione e Keq

G = G°' + RT lnQ = –RT lnKeq+ RT lnQ = = RT ln(Q/Keq) = RT ln ρ (con ρ Disequilibrium ratio) ρ Che valori assume ρ? Ovviamente tra 0 e 1 per G <0 Quanto più ρ è vicino a 0 tanto più G < 0 (reaz. spontanea) Dovete capire bene la differenza tra G e G° ' ρ (o G, che concettualmente è la stessa cosa) è considerato da molti un indice potenziale di regolazione: *se ρ è molto piccolo (0) si ritiene che l’enzima sia un potenziale sito di regolazione (se ρ 1 c’è poca possibilità di regolazione)

Il loro rapporto vale  (=Q), da cui posso calcolarmi G http://users.humboldt.edu/rpaselk/C431.F08/C431Notes/C431nLec31.htm

ΔG°' e ΔG in vivo nella glicolisi http://web.campbell.edu/faculty/nemecz/323_lect/glycolysis/energy.html

Perché ρ è considerato un indice di potenziale regolazione? I metaboliti devono essere a concentrazioni nel range μM- mM A) Non possono essere a concentrazioni molto alte (es. 1M) * perché ci sarebbero effetti osmotici pesanti * perché le variazioni nel metabolismo sarebbero lente (ci sarebbe molto intermedio da smaltire) * perché si investirebbe molto in intermedi (e non prodotti)

Kcat = Vmax/Etot = turnover number B) Non possono essere a concentrazioni molto basse (es. nM) * perché gli enzimi avrebbero Km basse e quindi una bassa efficacia catalitica: Kcat / Km vale al max 108-109 * perché gli intermedi verrebbero esauriti velocemente (non ci sarebbero riserve efficaci di metaboliti) kcat is called the turnover number kcat = moli di substrate trasformato / mole di enzima/secondo Kcat = Vmax/Etot = turnover number n. di reazioni catalizzate da ogni sito attivo ogni secondo; per un enzima MM vale K2. Non può essere maggiore della frequenza con cui substrato ed enzima si incontrano. Se ogni incontro è produttivo, si avrà la perfezione catalitica http://www.aw-bc.com/mathews/ch11/c11kkkk.htm

Quando [S] << KM (soluzioni diluite) ricaviamo Pendenza della retta ammettendo E= Etot : = (k2/KM)[E][S] ~ (kcat/KM)[E][S] Rate constant per reaz. Bimolecolare  Non può essere maggiore della velocità d’incontro

(kcat/KM) vale al massimo 108-109 cioè il valore massimo compatibile con la diffusione Diffusion theory predicts that kcat/KM will attain a value of about 108-109 (mol/L)-1s-1. Carbonic anhydrase, Catalase, Fumarase and Triose phosphate isomerase actually approach this limit. Sulla TIM e in generale sulla Glicolisi http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22593/#A2214 TIM accelerates isomerization by a factor of 1010 compared with the rate obtained with a simple base catalyst such as acetate ion. Indeed, the kcat/KM ratio for isomerization of glyceraldehyde 3-phosphate is 2 × 108 M-1 s-1.

Da Lehninger The kcat and activation energy of Rubisco from a variety of C3 and C4 plants Sage et al. J. Exp. Bot. (2002) 53:609-620. Sage et al.

Se questi 2 ragionamenti sono veri, ne consegue che : * quando G° ' <<0 la reazione deve rimanere lontana dell’eq. * quando G° '  0 (Keq 1) la reazione deve rimanere vicina all’eq. G <<0 G  0 Cosa significa (approssimativamente)? Cosa succederebbe infatti se le reazioni con G° ' <<0 andassero all’equilibrio?

[P] >> [S] Con due reazioni di questo tipo in fila (come ad es. nella glicolisi GG6PF6PF1,6BP*), allora: [S] << [P1]  [P2] << [P3] e più precisamente: ([F1,6BP][ADP]2 / [G][ATP]2) = 106 * La prima e terza reazione hanno un G grande e negativo. E cosa succederebbe se le reazioni con G° '  0 fossero lontane dall’equilibrio… [P] << [S]

Riassumendo: Le concentrazioni dei metaboliti possono rimanere dentro ambiti sensati (μM-mM) se le reazioni con * G° ' <<0 rimangono lontane dall’equilibrio (G <<0, vale a dire ρ 0). Tali reazioni quindi devono essere ben regolate! * G° '  0 rimangono vicine all’equilibrio (G  0) Queste reazioni devono essere catalizzate da enzimi in eccesso (altrimenti rallentando rimarrebbero lontane dall’equilibrio)

TPI aumenta la velocità della reazione 109 volte!! Da Lehninger TPI aumenta la velocità della reazione 109 volte!!

Referenze Per la cinetica enzimatica vedere * Testo di biochimica (ad es. Voet and Voet, Biochemistry) * Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 3 Per la parte di cinetica chimica vedere: * Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 1.4.2 e 1.4.3

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/inhibition.html Effect of reversible inhibitors on the reaction rate: � no inhib. a)� mixed inhib. ([I] = Ki = 0.5 Ki'); lower Vmaxapp (= 0.67 Vmax), higher Kmapp (= 2 Km). b)� competitive inhib. ([I] = Ki); Vmaxapp unchanged (= Vmax), higher Kmapp (= 2 Km). c)� uncompetitive inhib. ([I] = Ki'); lower Vmaxapp (= 0.5 Vmax) and Kmapp (= 0.5 Km). d)� noncompetitive inhib. ([I] = Ki = Ki'); lower Vmaxapp (= 0.5 Vmax), unchanged Kmapp (= Km).

A special case of uncompetitive inhibition is substrate inhibition which occurs at high substrate concentrations in about 20% of all known enzymes (e.g. invertase is inhibited by sucrose). It is primarily caused by more than one substrate molecule binding to an active site meant for just one, often by different parts of the substrate molecules binding to different subsites within the substrate binding site. If the resultant complex is inactive this type of inhibition causes a reduction in the rate of reaction, at high substrate concentrations. It may be modelled by the following scheme: http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/inhibition.html

Effect of substrate inhibition the reaction rate Effect of substrate inhibition the reaction rate. A comparison is made between the inhibition caused by increasing KS relative to Km. � no inhibition, KS/Km >> 100; � KS/Km = 100; � KS/Km = 10; � KS/Km = 1. By the nature of the binding causing this inhibition, it is unlikely that KS/Km < 1.

Competitiva

Incompetitiva

Quando α = α‘ si parla di in. non-competitiva (la Km non cambia) Mista Quando α = α‘ si parla di in. non-competitiva (la Km non cambia)

Effetto degli inibitori sui parametri cinetici