Il microscopio ottico Principi base Cristiano Rumio Dipartimento Anatomia Umana Università degli Studi di Milano

La parola microscopio è stata coniata dai membri dell’Accademia dei Lincei di cui faceva parte anche Galileo Galilei

Ingrandimento Un oggetto può essere visto a fuoco se posizionato ad una distanza non inferiore a circa 250 mm L’ingrandimento di un oggetto a 250 mm è cosiderato 1x Individui giovani che possono mettere a fuoco a distanza inferiori di 250 mm, potendo così portare l’ingrandimento a circa 2x,

RETINA LENTE SEMPLICE CAMPIONE IMMAGINE VIRTUALE

II LENTE IMMAGINE INTERMEDIA I LENTE CAMPIONE IMMAGINE VIRTUALE

Su questo principio si basa il microscopio composto. OCULARE OBIETTIVO

Ingr. totale = Ingr. oculare X Ingr. obiettivo

Anche il microscopio ha dei limiti: non basta infatti ingrandire per potere risolvere due oggetti vicini. L’ingrandimento eccessivo porta all’ingrandimento a vuoto: gli oggetti risultano più grandi ma non meglio risolti.

Il potere di risoluzione Potere di risoluzione (R): la minima distanza tra due oggetti a cui i due oggetti si vedono distinti Per quello che riguarda l’occhio umano: R=50mm Per quello che riguarda il microscopio ottico: R=250nm R

Il microscopio in campo chiaro Tubo Bi/Tri oculare Oculari Revolver porta obiettivi Tavolino porta oggetti con traslatore Edicola porta lampada con lampada Condensatore con diaframma d’apertura Diaframma di campo Condensatore di campo

Gli obiettivi Sistema di lenti a corta focale, responsabili del primo ingrandimento dell’immagine

Costruttore Correzioni Correzioni Apertura numerica Ingrandimento Obiettivo ad immersione Obj. Per usi particolari Working distance Lunghezza tubo stativo Codice colore Spessore coprioggetto

Abbreviation Abbreviation Type Achro, Achromat Achromatic aberration correction Fluor, Fl, Fluar, Neofluar, Fluotar Fluorite aberration correction Apo Apochromatic aberration correction Plan, Pl, Achroplan, Plano Flat Field optical correction EF, Acroplan Extended Field (field of view less than Plan) N, NPL Normal field of view plan Plan Apo Apochromatic and Flat Field correction UPLAN Olympus Universal Plan (Brightfield, Darkfield, DIC, and Polarized Light) LU Nikon Luminous Universal (Brightfield, Darkfield, DIC, and Polarized Light) L, LL, LD, LWD Long Working Distance ELWD Extra-Long Working Distance SLWD Super-Long Working Distance ULWD Ultra-Long Working Distance Corr, W/Corr, CR Correction Collar I, Iris, W/Iris Adjustable numerical aperture (with iris diaphragm) Oil, Oel Oil Immersion Water, WI, Wasser Water Immersion HI Homogeneous Immersion Gly Glycerin Immersion DIC, NIC Differential or Nomarski Interference Contrast Abbreviation Type ICS Infinity Color-Corrected System (Zeiss) RMS Royal Microscopical Society objective thread size M25, M32 Metric 25-mm objective thread; Metric 32-mm objective thread Phase, PHACO, PC Phase Contrast Ph 1, 2, 3, etc. Phase Condenser Annulus 1, 2, 3, etc. DL, DM Phase Contrast: dark low, dark medium PLL, PL Phase Contrast: positive low low, positive low PM, PH Phase Contrast: positive medium, positive high contrast (regions with higher refractive index appear darker) NL, NM, NH Phase Contrast: negative low, negative medium, negative high contrast (regions with higher refractive index appear lighter) P, Po, Pol, SF Strain-Free, Low Birefringence, for polarized light U, UV, Universal UV transmitting (down to approximately 340 nm) for UV-excited epifluorescence M Metallographic (no coverslip) NC, NCG No Coverslip EPI Oblique or Epi illumination TL Transmitted Light BBD, HD, B/D Bright or Dark Field (Hell, Dunkel) D Darkfield H For use with a heating stage U, UT For use with a universal stage DI, MI, TI Interferometry, Noncontact, Multiple Beam (Tolanski)

Costruttore Correzioni Correzioni Apertura numerica Ingrandimento Obiettivo ad immersione Obj. Per usi particolari Working distance Lunghezza tubo stativo Codice colore Spessore coprioggetto

N.A. Indice di qualità dell’obiettivo: potere di risoluzione, luminosità ecc.

La risoluzione del microscopio dipende da: lunghezza d’onda della luce utilizzata; apertura numerica (N.A.) dell’obiettivo. R = 0,61 l / N.A. N.A.= n sen a Descritta per la prima volta da Ernest Abbe e Carl Zeiss E’ un parametro della qualità dell’obiettivo a sempre inferiore a 90°

R = 0,61 l / n sen a Maggiore è l’angolo con cui l’obiettivo è in grado di raccogliere la luce maggiore è il potere di risoluzione Maggiore è N.A. minore è la distanza di lavoro

R = 0,61 l / n sen a

N.A Resolution (µm) 4x 0.13 2.12 10x 0.30 0.92 20x 0.50 0.55 40x 0.75 0.37 60x 0.85 0.32 100x 1.30 0.21

Rifrazione

Plan Achromat Plan Fluorite Plan Apochromat Magnification N.A   Plan Achromat Plan Fluorite Plan Apochromat Magnification N.A Resolution (µm) 4x 0.10 2.75 0.13 2.12 0.20 1.375 10x 0.25 1.10 0.30 0.92 0.45 0.61 20x 0.40 0.69 0.50 0.55 0.75 0.37 40x 0.65 0.42 0.95 0.29 60x 0.85 0.32 100x 1.25 0.22 1.30 0.21 1.40

Gli obiettivi all’infinito

Fascio a raggi paralleli OCULARE OCULARE IMMAGINE IMMAGINE INTERMEDIA OBIETTIVO OCULARE CAMPIONE IMMAGINE INTERMEDIA OBIETTIVO all’infinito OCULARE CAMPIONE Fascio a raggi paralleli IMMAGINE INTERMEDIA

Il condensatore Il condensatore è posto sotto al tavolino del microscopio. E’ un sistema di lenti che converge la luce proveniente dal condensatore di campo all’obiettivo E’ fornito di un diaframma: il diaframma di apertura

Il diaframma di apertura, invia nell’obiettivo un cono di luce più o meno ampio a seconda dell’N.A. dell’obiettivo. Permette quindi di sfruttare al massimo il potere di risoluzione del microscopio.

Le tre regole del buon condensatore Il condensatore deve essere di massima qualità, paragonabile a quella dell’obiettivo. Il condensatore deve avere la stessa apertura numerica dell’obiettivo. Per questo esiste il diaframma di apertura. In “teoria” il miglior condensatore per un dato obiettivo è l’obiettivo stesso.

Il tavolino traslatore

La regolazione secondo Kohler 1. La distribuzione uniforme della luce su tutto il campo 2. Il massimo sfruttamento dell’ A.N dell’obiettivo 3. L’eliminazione di raggi marginali e di luce diffusa che possono ridurre la qualità dell’immagine 4. La riproducibilità delle condizioni di osservazione

Il metodo di Kohler si applica in tre momenti successivi: 1. Centratura e regolazione in altezza del condensatore. 2. Regolazione del diaframma di campo. 3. Regolazione del diaframma di apertura. I punti 2 e 3 vanno attuati ad ogni cambio di obiettivo.

3°: REGOLAZIONE DEL DIAFRAMMA DI APERTURA. NO

Vale la pena di sottolineare ulteriormente la funzione dei diaframmi di campo e di apertura. DIAFRAMMA DI APERTURA DIAFRAMMA DI CAMPO

Il diaframma di campo varia la sezione del fascio ottico, illuminando superfici più o meno ampie del campo microscopico. La sua regolazione, in funzione dell’obiettivo usato, permette di inviare sul campione solo la luce necessaria ad illuminare il campo visto da quell’obiettivo.

Fotomicrografia di qualità scadente a causa del condensatore tenuto troppo basso.

Fotomicrografia di pessima qualità a causa del diaframma di apertura troppo chiuso, che determina una forte riduzione del potere di risoluzione.

Il condensatore dovrà essere accuratamente centrato, pena la difformità di illuminazione del campo.

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