ANALISI QUANTITATIVA L’analisi quantitativa UV-VIS si basa sulla legge di Lambert-Beer che esprime una relazione di proporzionalità tra la conc. di un analita e l’assorbanza a una determinata . Perchè tale legge sia applicata in analisi quantitativa devono essere rispettate due condizioni: - L’analita deve assorbire in modo rilevabile nell’intervallo spettrale 200-900 nm. Questo si verifica con una analisi spettrale dell’analita. Si identifica quindi la lunghezza d’onda (solitamente max) per l’analisi quantitativa - La relazione assorbanza/conc. deve essere lineare. Questo si verifica allestendo una curva di calibrazione Esistono diversi fattori che possono provocare deviazioni dalla linearità tra cui fattori fisici/chimici, fattori strumentali e operativi

Fattori fisici e chimici L’indice di rifrazione della soluzione varia al variare della concentrazione (quando è elevata) e di conseguenza varia anche la  poiché la rifrazione fa variare la lunghezza d’onda della radiazione incidente. Per ridurre tale inconveniente, di solito si lavoro con soluzioni diluite 10-2 – 10-7 M. A concentrazioni elevate, le molecole possono formare dimeri e polimeri, anche aggregati con il solvente. Di conseguenza si possono osservare deviazioni positive o negative dalla legge di lambert Beer Formazione di dimeri Formazione di polimeri Assorbanza concentrazione Variazioni di pH, temperature e solvente possono avere effetto sulla linearità In soluzioni torbide la luce incidente viene in parte persa per effetto della diffusione con un aumento (apparente) della assorbanza. Si risolve il problema utilizzando opportuni sistemi in grado di raccogliere la luce dispersa (sfera integratice)

Per soluzioni molto concentrate, P diminuisce e al limite si annulla concentrazione Assorbanza Radiazione monocromatica Banda stretta Banda larga Fattori strumentali L’ampiezza della banda passante, oltre ad essere decisiva sulla precisione e accuratezza dell’analisi, influisce inoltre sulla linearità della legge di lambert Beer. La luce diffusa dovuta a cause strumentali altera l’ assorbanza soprattutto per soluzioni concentrate (la curva assume pendenza negativa) Per soluzioni molto concentrate, P diminuisce e al limite si annulla P0 + S P0 + S A = log A = log P + S S

CALIBRAZIONE La calibrazione determina la relazione tra la risposta analitica e la concentrazione dell’analita. Di solito tale operazione si effettua mediante standard. Calibrazione con std. esterno Lo std. esterno viene preparato separatamente dal campione (al contrario lo std. Interno è aggiunto al campione stesso). Si prepara una serie di std. esterni contenenti l’analita a concentrazioni note (almeno 3 conc., metodo della diluizione progressiva). Si misura quindi l’assorbanza rispetto alla concentrazione dell’analita e e si determina la curva di calibrazione fittando i dati con un’appropriata equazione matematica, quale la relazione lineare usata nel metodo dei minimi quadrati

y=mx y=mx+b y x m= y/x Il metodo dei minimi quadrati L’assorbanza (ordinata) è la variabile dipendente mentre concentrazione (ascissa) è la variabile indipendente. In condizioni ideali tutti i punti sono allineati con l’origine degli assi (ratta passante per lo 0, y= mx). In condizioni reali, a causa degli errori indeterminati associati al processo di misurazione, non tutti i dati si trovano sulla stessa linea y=mx y=mx+b y x m= y/x

In tali condizioni bisogna derivare la “migliore” retta che interpoli i punti. L’analisi dei minimi quadrati lineare fornisce l’equazione della migliore retta passante tra un insieme di dati x,y, assumendo che ogni deviazione dei punti dalla linea retta deriva da un errore commesso nel corso della misurazione. Quindi si assume che ai valori x, ovvero alla preparazione delle concentrazioni, non è associato alcun errore La linea costruita con il metodo dei minimi quadrati è quella che minimizza la somma dei quadrati dei residui (deviazione verticale di ciascun punto dalla retta) corrispondenti a tutti i punti

Uso di Excel nel calcolo dei minimi quadrati 1. Inserire i dati x e y su due colonne 2. Selezionare una serie di celle con larghezza pari a due celle e lunghezza cinque

3. Selezionare la funzione statistica REGR.LIN 4. Compilare gli argomenti funzione come indicato 5. Per visualizzare i risultati digitare la seguente combinazione Ctr+Shift+Invio

y = mx + b pendenza intercetta d.s. pendenza d.s. intercetta Coeff. di deter. (R2) d.s. della regressione gradi libertà F Somma quadrati regr. Somma quadrati residui y = mx + b Pendenza = m Intercetta = b Coefficiente di determinazione (R2): è un indice della variazione totale tra il valore y misurato e quello derivante dalla relazione lineare determinata. Il valore va da 0 a 1. Più il valore di R2 si avvicina all’unità meglio il modello lineare esprime le variazioni di y

Rappresentazione grafica

Il metodo dell’aggiunta standard Tale metodo si applica qualora l’analita sia in una matrice più o meno complessa  possibile interferenza dei componenti della matrice con la determinazione dell’analita. Per eliminare tali interferenze bisognerebbe preparare una serie di std. che riproducono esattamente il campione (spesso non è possibile). In tali casi si utilizza il metodo dell’aggiunta standard che controbilancia gli effetti della matrice. Il metodo prevede l’aggiunta di diverse aliquote di una soluzione std. ad uguali aliquote di campione. Vs=volume soluzione std. Cs Vt Vx=volume soluzione incognita Cx Diverse aliquote uguali Vx della soluzione incognita di concentrazione Cx sono trasferiti in matracci volumetrici aventi volume Vt. A ciascuno di essi è aggiunto un volume variabile Vs di una soluzione std. a concentrazione nota Cs. Si determina sperimentalmente la assorbanza.

L’assorbanza della soluzione è descritta da:  b Vs Cs Vt  b Vx Cx Vt As = + = k VsCs + kVxCx Dove k è una costante uguale a  b/Vt . Un grafico di As in funzione di Vs, produce una linea retta di equazione: As= mVs + b ove m= kCs e b= kVxCx Dall’analisi dei minimi quadrati si determina m e b. m kCs Cx = bCs mVx = b kVxCx

Esempio metodo delle aggiunte std. Aliquote di 10 ml di un campione di Fe3+ di una soluzione incognita vengono aggiunte in matracci volumetrici da 50 ml. Esattamente 0.00, 5.00, 10.00, 15.00 e 20.00 ml di una soluzione std. contenente 11.1 ppm di Fe3+ vengono aggiunti a ciascuna aliquota, seguiti da un eccesso di ione tiocianato, per dare il complesso Fe(SCN)2+ . Dopo diluizione a volume le assorbanze misurate risultano rispettivamente: 0.240, 0.437, 0.621, 0.809 e 1.009. Calcolare la concentrazione di ioni Fe3+ della soluzione incognita. m = 0.0382 b = 0.2412 bCs Cx = mVx 7.01 ppm Fe3+

Spettri solo in parte sovrapposti Analisi di miscele L’assorbanza di una soluzione ad una particolare lunghezza d’onda è uguale alla somma delle assorbanze di tutte le specie presenti nella soluzione Assorbanza di una miscela A = x b [X] + Y b [Y] + Z b [Z] + ….. Si consideri un miscela costituita da due composti X e Y, si distinguono due casi: Spettri sovrapposti Spettri solo in parte sovrapposti

Procedimento per l’analisi di una miscela i cui componenti presentano spettri sovrapposti Si consideri l’analisi dei complessi di Ti(IV) e V(V) con H2O2

Determinare l’assorbanza di ciascun std. a diverse lunghezze d’onda Calcolare l’assorbività molare a ciascuna lunghezza d’onda mediante la legge di Beer [Ti] std= 0.00132 M [V] std= 0.00189 M

(non si conoscono tuttavia [X] e [Y] 3. Misurare l’assorbanza della miscela che è data dalla somma delle assorbanze delle componenti Am = x b [X] + Y b [Y] (non si conoscono tuttavia [X] e [Y]

Acalc = x b [X] + Y b [Y] Valori stimati 3. Stimare la concentrazione di X e Y (il valore stimato non deve necessariamente essere vicino al valore vero) e calcolare usando la funzione Excel, il valore ai A calc mediante l’equazione Acalc = x b [X] + Y b [Y] Valori stimati

4. Calcolare con funzione Excel il quadrato della differenza tra l’assorbanza calcolata e quella misurata [Acalc-Am]^2 5. Calcolare con funzione Excel la somma dei quadrati [H9 =SOMMA(H4:H8)]

5. Effetuare l’analisi dei minimi quadrati per minimizzare la somma dei quadrati [Acalc-Am]^2 variando le concentrazioni di [X]stima e [Y]stima. I valori “ migliori” di [X]stima e [Y]stima sono quelli che rendono minima la somma dei quadrati (cella H9). Excel contiene una macro per lo svolgimento della minimizzazione (RISOLUTORE) Se non presente scegliere componenti aggiuntivi dal menu strumenti e selezionare aggiunta risolutore

6. Impostare i parametri di minimizzazione e quindi risolvere l’analisi

A’’ = ’’X b [X] + ’’Y b [Y] Procedimento per l’analisi di una miscela i cui componenti presentano spettri risolti Se gli spettri dei componenti di una miscela sono risolti sufficientemente (come nel caso di 1 e 2), le concentrazioni della miscela si determinano risolvendo una sistema di due equazioni A’ = ’X b [X] + ’Y b [Y] A’’ = ’’X b [X] + ’’Y b [Y] Ove A’ e A’’ sono l’assorbanza rispettivamente a ’ e ’’

A’’ = ’’X b [X] + ’’Y b [Y] Risolvendo l’equazione nelle due incognite X e Y si ottengono i seguenti risultati: A’ ’Yb A’’ ’Yb ’Xb A’ ’’Yb A’’ [X] = [Y] = ’Xb ’Yb ’’Yb ’Yb ’Xb ’Yb ’’Yb ’Yb a b c d Ciascun simbolo è detto determinante ed è un modo abbreviato per scrivere (a x d) – (c x b)

Si considerino le sostanze X e Y le cui assorbività molari sono di seguito riportate  (nm) X Y 272 16440 3870 327 3990 6420 Una mscela di composti X e Y è caratterizzata da una assorbanza di 0.957 a 272 nm e di 0.559 a 327 nm. Calcolare la concentrazione di X eY nella miscela

Punto isosbestico Se in una reazione chimica una specie assorbente X viene convertita un un’altra specie assorbente Y e se gli spettri delle due specie si intersecano in un punto, qualsiasi spettro registrato durante tale reazione passerà per quel punto detto punto isosbestico L’esistenza del punto isosbestico è una buona prova del fatto che esistono solo due specie principali