Tissue engineering: formazione di lembi di cartilagine e cute, utilizzando cellule staminali adulte e loro applicazioni cliniche. Borgo Roma – 12/12/05

Ingegneria tessutale: I parte Ingegneria tessutale: concetti generali

Uno dei maggiori obiettivi della medicina moderna è quello di ripristinare tessuti e/o organi danneggiati da malattie o traumi. Nel XX secolo i trapianti di tessuti (osso, muscolo e cute) e di organi (rene, fegato, polmone) sono stati introdotti con successo nella pratica terapeutica grazie all’impiego di tecniche di anastomosi microvascolari e di idonea terapia immunosoppressiva. Nonostante ciò, molti sono i problemi legati al trapianto di organi, tra i quali i più significativi sono:

scarsa disponibilità di tessuti e d’organi idonei al trapianto e conseguenti lunghi tempi di attesa, necessità di sottoporre il Paziente a terapia immuno-soppressiva per tutta la vita con conseguenti deficit immunitari, rischio di tromboembolia nel caso in cui vengano utilizzati materiali sintetici (ad esempio per le valvole cardiache) e di emorragie conseguenti al trattamento anticoagulante, necessità di sottoporre il paziente a più trapianti (ad esempio per rigetto tardivo o utilizzo in pazienti giovani di materiale sintetico non in grado di adeguarsi alla crescita corporea).

Ingegneria Tessutale L’ingegneria tessutale è un’ area multidisciplinare di ricerca che ha come scopo la rigenerazione di tessuti ed organi danneggiati del nostro organismo, partendo dal presupposto che la quasi totalità delle cellule animali possono essere coltivate in laboratorio. Il principio generale è quello di prelevare cellule staminali dallo stesso paziente bisognoso di trapianto, farle crescere e differenziare su un supporto idoneo in modo da produrre il tessuto che deve essere sostituito.

E’ molto importante che: venga prodotta una quantità di cellule e di tessuto sufficiente per riparare il difetto, venga garantita una giusta differenziazione cellulare in modo da mantenere un corretto fenotipo, venga riprodotta una struttura tridimensionale identica al tessuto o organo da sostituire per garantire una corretta vascolarizzazione.

II parte Cellule staminali: concetti generali

Cellule staminali sono distinte in: totipotenti: potenzialmente capaci di originare qualsiasi tipo di tessuto. Possono creare un organismo completo. pluripotenti (multipotenti): possono sviluppare una vasta gamma di tessuti ( ad esempio le cellule progenitrici della linea ematopoietica), ma non sono in grado di sviluppare un organismo completo. unipotenti: sviluppano una sola linea cellulare.

Le cellule adibite alle colture possono provenire da prelievi: autologhi: le cellule vengono prelevate dallo stesso Paziente che necessita del trapianto; omologhi: le cellule vengono prelevate da un individuo della stessa specie (vivente o cadavere); eterologhi: le cellule sono prelevate da un donatore di specie diversa dal ricevente, per esempio il maiale per l’uomo.

Le cellule che possono essere impiegate per la rigenerazione e riparazione tessutale possono provenire da: 1- cellule staminali embrionali: si tratta di cellule totipotenti. La loro estrazione richiede la soppressione dell’embrione, che non supera mai i 14 giorni dalla sua fecondazione. Vengono distinte:

Staminali embrionali a- eterologhe: stadio di blastocisti – V giornata prima dell’impianto in utero; (embrioni sovrannu- merari rimasti inutilizzati nelle cliniche per la fertilità) b- autologhe: sono prelevate dopo che il nucleo di una cellula adulta viene trasferito in un uovo privato del suo nucleo. Possiedono lo stesso patrimonio genetico del donatore della cellula adulta e possono essere trapiantate senza rischi di rigetto (clonazione terapeutica)

Staminali fetali dall’ottava settimana al parto sono cellule tendenzialmente pluripotenti. derivano per più da materiale autoptico. Poco studiate.

Staminali da cordone ombelicale possono essere sia autologhe che omologhe scarse complicanze immunologiche poco numerose applicazioni sembrano ristrette solo alla produzione di cellule emopoietiche.

Staminali adulte multipotenti : provvedono al mantenimento dei tessuti e alla loro riparazione Possono essere: multipotenti : le piu’ studiate sono nel midollo osseo CD34+ emopoietiche cellule mesenchimali {osteoblasti, condrociti, adipociti}

Staminali adulte unipotenti o mature: sviluppano una sola linea cellulare (cellule differenziate), basso indice proliferativo oggetto delle mie ricerche (cheratinociti, condrociti e fibroblasti).

Importanza Facilmente disponibili Storia del donatore Non problemi etici Sorgente rinnovabile Autotrapianti Plasticità

Plasticita' è la capacità di una cellula staminale di produrre cellule figlie che esprimono diversi fenotipi maturi. La plasticità consente ad una cellula staminale impiantata in tessuti già differenziati, di dare origine a tipi cellulari non presenti nel tessuto di origine della cellula staminale stessa. Così, ad esempio, una cellula staminale del midollo osseo può dare origine ad una cellula epatica, cardiaca o nervosa. Questa capacità (detta transdifferenziazione) è strettamente dipendente dalle influenze del microambiente in cui la cellula staminale si trova a crescere.

Ingegneria dei tessuti III parte Ingegneria dei tessuti coltura di condrociti

Istologia - cartilagine Condrociti Fibre Sostanza intercell. Sostanza amorfa

Istologia Esistono tre tipi di cartilagine: ialina, elastica, fibrosa. Tutti i tre tipi sono costituiti da condrociti da matrice extra-cellulare

Cartilagine ialina E’ caratterizzata da fibre collagene prevalentemente di tipo II che formano un delicato reticolo immerse in un’abbondante matrice amorfa o sostanza fondamentale ricca in complessi proteico – mucopolisac-caridici.

Istologia A. Pas (40x) I condrociti sono ac-colti in spazi scavati detti lacune Le lacune si conden-sano a formare le “capsule”

Istologia Ematosilina (10x) Le cellule figlie formano un clone di elementi accostati tra loro Tali cloni sono denominati gruppi isogeni

Cartilagine fibrosa E’ caratterizzata dalla presenza di grossi fasci fibrosi di collagene in una scarsa matrice la cartilagine fibrosa è una forma di transizione tra il tessuto connettivo denso o compatto e la cartilagine

Cartilagine elastica La cartilagine elastica presente ad esempio nel padiglione auricolare e nel naso è caratterizzata dalla presenza di fibre di elastina e da scarsa sostanza amorfa nella matrice extracellulare.

Cartilagine ialina La principale funzione della cartilagine ialina è quella di facilitare lo scorrimento delle superfici articolari e di trasfe-rire il peso al sottostante osso. Quando danneggiata, la cartilagine presenta scarsa ca-pacità rigenerativa a causa dell’assenza di vascolarizza-zione e di innervazione

Danni cartilaginei della sola matrice difetto parziale difetto a tutto spessore

Il naturale processo di riparazione porta alla formazione di tessuto fibro-cartilagineo che non presenta le caratteristiche di resistenza e deformabilità al carico tipiche della cartilagine ialina e che sono dovute alla sua particolare composizione biochimica

Nonostante numerosi protocolli terapeutici siano stati proposti ed applicati, i risultati soprattutto a lungo termite sono risultati insoddisfacenti.

Formazione di cartilagine mediante ingegneria tessutale due obiettivi Il primo è quello di aumentare il numero di cellule per raggiungere la quantità necessaria per riparare il difetto cartilagineo. Il secondo è quello di ottenere il fenotipo corretto TRAMITE

Cellule in sospensione Cellule seminate su supporto

La presenza di una lesione cartilaginea viene normal-mente riscontrata durante un esame artro-scopico. Durante tale esame, si può procedere ad un prelievo di una piccola quantità di cartilagine sana in una zona non di carico.

La biopsia viene quindi inviata al laboratorio di colture cellulari, dove i condrociti si moltiplicano in accurate condizioni di asepsi. Dopo circa 3 – 4 settimane le cellule sono in numero sufficiente per essere re-impiantate; trattandosi di cellule autologhe, non vi sono rischi di infezioni o di reazioni di rigetto.

A questo punto si procede alla seconda parte dell’intervento: si incide l’articolazione, si raschiano i bordi e si pulisce il letto della lesione, rimuovendo la cartilagine danneggiata così da rendere l’area atta a ricevere le cellule coltivate Una piccola incisione viene eseguita sulla tibia per prelevare un lembo di periostio che ricopre la parte anteriore e mediale della superficie ossea.

Il lembo viene quindi suturato sopra la lesione ed il ricettacolo così creato potrà ricevere i condrociti coltivati. Le cellule aderendo all’osso sottostante, rigenereranno gra-dualmente un nuovo tessuto cartilagineo che nel tempo assumerà caratteristiche simili alla cartilagine originaria.

Tuttavia, dopo i primi risultati incoraggianti tale procedura ha mostrato dei difetti: metodica invasiva risultati non sempre soddisfacenti (Breinan – 1997).

Uso di supporti - scaffolds L’impiego di componenti cellulari supportati da scaffolds adeguati, potrebbe condurre a risultati positivi nella riparazione del tessuto articolare, consentendo un miglioramento della tecnica chirurgica. L’impiego di scaffolds consente infatti: di migliorare l’attecchimento, la riproduzione e la differenziazione cellulare, di trattenere “fisicamente” le cellule nella zona da riparare.

Biomateriali devono possedere le seguenti caratteristiche: tollerabilità: devono essere immunologicamente inerti, impalcatura provvisoria: dopo integrazione il biomateriale deve essere sostituito dal tessuto originario, contenuto informativo: devono comunicare e scambiare segnali con le cellule ospite.

Le matrici più idonee per la crescita di condrociti e di cheratinociti autologhi, sono di tipo naturale e sono collagene e derivati fibrina anche autologa acido ialuronico cellulosa Grande interesse viene rivolto al collagene; questa molecola si è dimostrata in grado di ricostruire un epitelio con caratteristiche morfo-funzionali nettamente superiori rispetto alle altre matrici.

Obbiettivo della ricerca Isolare i condrociti umani autologhi per la ricostruzione della cartilagine articolare su supporto di collagene

Isolamento dei condrociti Asportazione di cartilagine dal condilo femorale di un Paziente di sesso maschile di anni 63 Frammenti di cartilagine trattati con tre enzimi ( ialuronidasi, pronasi, collagenasi) per togliere la matrice extracellulare

Risultati L’estrazione dei con-drociti ottenuta nel nostro esperimento da frammenti di cartilagine ha per-messo di ottenere 2 milioni di cellule, seminate in seguito in fiasca F 75

Microscopio a contrasto di fase

Condrociti dopo 48 ore - 20 x

40 x

40 x

Coltura primaria di condrociti prima settimana - 10 x

Coltura primaria di condrociti prima settimana - 20 x

Coltura primaria in subconfluenza inizio della seconda settimana - 20 x

Coltura primaria in subconfluenza inizio della seconda settimana - 40 x

Coltura primaria in confluenza alla fine della seconda settimana

Tripsinizzazione dalla fiasca e risemina su supporto

III settimana - inizio Ematossilina - eosina - 10 x

ICH - vimentina

ICH - vimentina

III settimana - inizio Ematossilina - eosina - 20 x

III settimana - inizio Ematossilina - eosina - 40 x

III settimana - fine Ematossilina - eosina - 20 x

IV settimana - inizio Ematossilina eosina - 10 x

IV settimana - inizio Ematossilina eosina - 20 x

IV settimana - fine Ematossilina eosina - 20 x

IV settimana - inizio Ematossilina eosina - 40 x

IV settimana - istochimica Alcian PAS - 40 x

IV settimana - istochimica Alcian PAS - 40 x

ICH: collagene II Marker caratteristico della cartilagine ialina

Abbiamo verificato la possibilità di crescita con corretta differenziazione dei condrociti su biomateriali (spugnette di collagene di tipo I) questi possono essere utilizzati per reimpianto nella sede lesionata