Gli enzimi accelerano le reazioni anche di un milione di volte. Se non ci fossero gli enzimi la maggior parte delle reazioni dei sistemi biologici procederebbe a velocità non apprezzabili

ENZIMI Catalizzatori prodotti da cellule viventi ma capaci di agire indipendentemente da esse Determinano tutti i processi di degradazione, sintesi, trasformazione e conservazione dell’energia nella formazione ed evoluzione della materia vivente.   Sono PROTEINE spesso associate ad un metallo o molecola organica

Gli enzimi sono altamente specifici sia nei riguardi della reazione catalizzata sia nei riguardi dei substrati

Esiste in vasto repertorio chimico dei gruppi funzionali degli aa Esiste in vasto repertorio chimico dei gruppi funzionali degli aa. Tuttavia essi spesso non riescono a soddisfare i fabbisogni chimici della catalisi. L’attività catalitica di molti enzimi dipende dalla presenza di piccole molecole, chiamate cofattori, il cui ruolo può essere diverso da enzima ad enzima

La proteina enzimatica senza il suo cofattore è detto apoenzima, mentre la sua forma completa e cataliticamente attiva è detta oloenzima. I cofattori possono essere suddivisi in due gruppi: piccole molecole organiche dette coenzimi metalli

Il ΔG è utile per comprendere il funzionamento degli enzimi L’energia libera (G) è una funzione termodinamica che rappresenta una misura dell’energia utile, cioè dell’energia in grado di compiere un lavoro

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Il ΔG non fornisce informazioni sulla velocità di reazione. ΔG < 0 non significa che la reazione avviene ad una velocità apprezzabile Gli enzimi aumentano la velocità ma non influenzano la posizione dell’equilibrio

CATALISI ⇓ legata ai gruppi R degli amminoacidi la cui natura e disposizione residua individua una tasca detta SITO ATTIVO. E’ fondamentale la conformazione nativa della proteina per la sua funzione catalitica.   DENATURAZIONE ⇒ MODIFICA STRUTTURA NATIVA ⇒ DISATTIVAZIONE DELL’ENZIMA  

La formazione del complesso enzima-substrato è la prima tappa nella catalisi enzimatica Il potere catalitico degli enzimi deriva dalla loro capacità di avvicinare i substrati con un orientamento favorevole e promuovere la formazione di stati di transizione Gli enzimi formano il complesso enzima-substrato (ES) in una specifica regione detta sito attivo

Il sito attivo di un enzima è la regione a cui si lega il substrato E’ costituito da una tasca o fenditura tridimensionale formata da gruppi che derivano da parti diverse della sequenza amminoacidica della proteina Quasi tutti gli enzimi sono costituiti da più di 100 aa Il sito attivo occupa una parte relativamente piccola del volume totale di un enzima

Il sito attivo 15

Un enzima complementare al suo substrato potrebbe essere un cattivo enzima. Per poter catalizzare una reazione, un enzima deve essere complementare allo stato di transizione della reazione

Meccanismo catalisi enzimatica

CATALISI OMOGENEA sub. e cat. nella stessa fase CATALISI ETEROGENEA sub. e cat. in fasi diverse   Incremento di velocità 108-1020 volte con eventuale fondamentale intervento di componenti non proteiche (ioni Me o coenzimi). Struttura tridimenzionale dell’E fondamentale per la conoscenza dello stato di transizione e quindi del meccanismo di reazione. SITO ATTIVO = PARTE DELL’ENZIMA IN CONTATTO CON IL SUBSTRATO (zona piccola in confronto alle dimensioni dell’enzima). Modificazioni sito attivo scomparsa attività enzimatica.

Molecola su cui opera l’enzima = substrato Struttura primaria e strutture superiori determinate dalla sintesi proteica = predestinazione di una proteina a funzionare da enzima.  PM enzimi = da 12000 a 106 Molecola su cui opera l’enzima = substrato   DIMENSIONE ENZIMA » DIMENSIONE SUBSTRATO

Apoenzima(denaturato con cal.) + cofattore o gruppo prostetico (stabile al riscaldamento) ⇓ Enzima completo (oleoenzima) Enzimi richiedono cofattori per funzionare che possono essere ioni inorganici (Fe, Mg, Mn, Zn, Mo etc.) o molecole organiche (coenzimi) che possono essere:   legati debolmente alla proteina   legati saldamente alla proteina (gruppo prostetico)

ATP ⇒ metabolita coezimatico + comune (cosubstrato modificato nella reazione e dissociato)   NAD+ e NADP+ ⇒ coenzimi nucleotidici piridinici associati a deidrogenasi che catalizzano il trasferimento di un H- da un substrato al nucleotide portandolo nella forma ridotta con rilascio di H+ Coenzima A ⇒ coenzima derivato dall’acido pantotenico è coinvolto nel trasferimento di gruppi acilici CH3CO- Altri coenzimi sono: Biotina, Acido Lipoico, vitamine A, D, E e K.

Idrolizzano il legame peptitico e glicosidico

Enzimi identificati da 4 numeri: 1 Enzimi identificati da 4 numeri:   1.   Appartenenti a una delle classi relative alla reazione catalizzata 2.   Appartenenza ad una sottoclasse 3.   Appartenenza ad una sottosottoclasse 4. Posizione progressiva nella sottosottoclasse

Esempio ATP + glucosio = ADP + glucosio-6-fosfato Catalizzatore esochinasi (nome comune) o ATP-glucofosfotransferasi (catalizza il trasferimento del P da ATP a glucosio). Numero dell’enzima 2.7.1.1. 2. classe delle transferasi 7. sottoclasse fosfotransferasi 1.   sottosottoclasse fosfotransferasi con OH come gruppo accettore 1.glucosio come accettore del gruppo fosforico.

SPECIFICITA’ DEGLI EMZIMI Enzima Chirale riesce a distinguere tra gruppi della molecola stericamente non equivalenti.   Risulta perciò altamente specifico e distingue due diversi stereoisomeri o nella reazione con un centro Pro-chirale genera uno solo dei possibili isomeri (geometrici o ottici) SPECIFICITA’ DEGLI EMZIMI Un enzima può avere diversi gradi di specificità: Specificità che tiene conto del legame (specificità di legame, Bassa specificità) Specificità che tiene conto di una parte della molecola (specificità di gruppo) Specificità che richiede le due parti della molecola ed il legame che le unisce (specificità assoluta).

Es. A-B + H2O = AOH + BH la natura di A e B non è importante A o B devono essere determinate A e B devono essere del tipo appropriato. Maltasi: catalizza l’idrolisi del maltosio ma essa può operare sugli a-glucosidi cioè sul glucosio legato con legame a-glucosidico ad un altro zucchero qualsiasi (specificità di gruppo).

Meccanismo reazione enzimatica Catalisi per abbassamento Ea per stabilizzazione chimica del complesso attivato e/o + corretto orientamento geometrico per la formazione del complesso attivato E con S forma ES ad energia + bassa in un equilibrio non alterato, riuscendo a discriminare tra parecchi substrati (specificità) in competizione per il S.A. nel quale ci sono gruppi funzionali che: Reagiscono temporaneamente con S Predispongono S a formare P

I gruppi catalitici di E interagendo con S lo preparano (attivano) alla reazione abbassando Ea. Tra substrato-enzima si forma il complesso ES la cui energia di legame serve per: ridurre l’entropia (avvicinamento e orientamento substrato) desolvatare il substrato indurre binding produttivo o adattamento indotto Dall’energia del legame E-S dipendono la catalisi e la specificità.

Desolvatazione 37

DIVERSI TIPI DI CATALISI   Catalisi acido base specifica se dovuta a H+ o OH- o generale se dovuta a gruppi accettori o donatori di protoni (sulle catene laterali degli a.a. e più comune al pH 7 della cellula) Catalisi covalente mediante formazione di un complesso attivato stabile per la formazione di legami covalenti tra E ed S.

Cinetica Enzimatica Vo [S] La velocità iniziale di una reazione aumenta quasi linearmente all'aumentare della concentrazione di substrato. Vo La velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e la reazione è di primo ordine V = k [S] [S]

Cinetica Enzimatica Vmax V La proporzionalità fra V e [S] progressivamente diminuisce. Vmax V La velocità iniziale diventa indipendente dalla [substrato] e la reazione è di ordine zero rispetto al substrato. All’aumentare della concentrazione di substrato la proporzionalità fra V e [S] progressivamente diminuisce, e si registrano solo minimi incrementi di velocità anche per elevate variazioni della concentrazione di substrato. Il valore della velocità misurato in queste condizioni viene detto velocità massima o Vmax. [S] 41

Il complesso ES è la chiave per comprendere la cinetica enzimatica E + S ES ES K1 K-1 K2 K-2 E +P La seconda reazione è più lenta e quindi limita la velocità globale. In qualsiasi istante l’enzima è presente nella forma libera e in quella combinata. Quando la [S] è bassa, l’enzima sarà per lo più nella forma libera. Quindi via via che [S] tende ad aumentare viene favorita la formazione di ES.

La velocità iniziale massima della reazione (Vmax) si osserva quando tutto l’enzima è presente sotto forma di complesso ES. Questa condizione, però, esiste solo quando [S] è elevata. L’effetto saturante del substrato è una proprietà caratteristica degli enzimi responsabile dell’appiattimento della curva.

E +S ES E +P La velocità di catalisi Vo, definita come moli di prodotto formate al secondo, viene determinata dalla demolizione di ES per dare origine a P, quindi Vo = K2[ES] K1 K-1 K2

Alla fine Vo = Vmax [S] Km + S Equazione di Michaelis-Menten dove: costante di Michaelis-Menten Quando Vo= 1/2Vmax = Vmax [S] Km + S Vmax 2

Dividendo per Vmax si ha: 1 = 2 Km +[S] Risolvendo per Km abbiamo Km+[S] = 2S Oppure Km=[S] quando Vo=1/2 Vmax Quindi Km è equivalente alla concentrazione del substrato a cui Vo è metà della Vmax Vmax e Km possono variare considerevolmente passando da un enzima all’altro. Sono parametri calcolabili sperimentalmente

Grafico di Michaelis-Menten

Significato delle costanti cinetiche Lo studio della cinetica enzimatica è importante per vari motivi: Aiutano a comprendere come lavorano gli enzimi Aiutano a comprendere come lavorano in vivo: le costanti cinetiche Km e Vmax, sono di estrema importanza per capire come gli enzimi si coordinano tra loro a livello metabolico Permettono confronti tra organi e tra specie Possono essere usate a scopo clinico-diagnostico

Andamento cinetico 49

Cinetica Enzimatica Vo=Vmax Vmax V ½ Vmax Km [S] All’aumentare della concentrazione di substrato la proporzionalità fra V e [S] progressivamente diminuisce, e si registrano solo minimi incrementi di velocità anche per elevate variazioni della concentrazione di substrato. Il valore della velocità misurato in queste condizioni viene detto velocità massima o Vmax. Km [S]

La costante di Michaelis (KM) KM = K2 +K-1 /K1 K2 è la costante che limita la velocità (stadio lento) per cui è >> di K-1 che è la costante di dissociazione del complesso ES kM kM kM kM kM kM kM affinità Quindi la KM è la concentrazione del substrato alla quale la metà dei siti per il substrato sono saturati. Quindi KM fornisce una misura della conc di substrato richiesta affinchè la catalisi abbia luogo

KM e Vmax sono importanti caratteristiche degli enzimi Per la maggior parte degli enzimi KM varia da 10-1 a 10-7

Effetti della concentrazione dell’enzima Raddoppiando le molecole di enzima avremmo il doppio di molecole di substrato legate all'enzima e ci si aspetterebbe un raddoppio della velocità, come è in realtà: Vmax è direttamente proporzionale alla [E] Km è indipendente dalla [E] e dalla [S]

La Vmax esprime il numero di turnover degli enzimi, cioè il numero di molecole di substrato convertite in prodotto da una molecola enzimatica nell’unità di tempo quando l’enzima è totalmente saturato dal substrato

kcat o numero di turnover Unità Internazionale la quantità di enzima che catalizza la formazione di una micromole di prodotto in un minuto kcat o numero di turnover il numero di molecole di substrato convertite in prodotto nell'unità di tempo da una molecola di enzima quando è saturata con il substrato. La concentrazione dell’enzima può essere espressa in termini di attività osservata.

Il numero di turnover dipende da k2 che è detta anche kcat Il numero di turnover dipende da k2 che è detta anche kcat. Se è nota la conc totale di siti attivi [E]T, allora Vmax = k2 [E]T quindi K2 = Vmax/ [E]T

kcat kcat kcat kcat kcat E + S ES E + P kcat = k2 Vmax = kcat [ET] attività molecolare La costante di velocità indicata come kcat identifica la costante della tappa limitante la velocità della intera reazione Se una reazione si verifica secondo un meccanismo a due stadi come quello previsto da Michaelis-Menten E’ una costante di primo ordine ed è espressa in s-1 . efficienza catalitica

Enzima kcat catalasi 40 000 000 anidrasi carbonica 1 000 000 acetilcolinesterasi 14 000 lattato deidrogenasi 1 000 chimotripsina 100 DNA polimerasi 15 lisozima 0,5

Il rapporto Kcat/KM è una misura dell’efficienza catalitica Quando la conc del substrato è molto più elevata di KM la velocità della reazione catalizzata è uguale a Vmax Però dentro la cellula la maggior parte degli enzimi non sono saturati dal substrato

Riportando l'equazione di Michaelis-Menten nella forma è possibile ottenere il grafico dei doppi reciproci (o di Lineweaver-Burk), rappresentando graficamente l'andamento di 1/V in funzione di 1/[S]. In tal modo si ottiene una retta con intercetta sull'asse delle ascisse nel punto - 1/KM, sull'asse delle ordinate nel punto 1/Vmax e con coefficiente angolare pari al rapporto KM/Vmax.

Che cosa influenza la velocità della reazione? Velocità di reazione pH Pepsina Chimotripsina Tripsina Temperatura, °C Velocità di reazione TEMPERATURA pH A number of external factors affect the activity of enzymes in speeding conversion of reactants to products. These factors, including variations in the concentration for substrate molecules, temperature, and pH, speed or slow enzymatic activity in highly characteristic patterns. A higher temperature generally results in an increase in enzyme activity. As the temperature rises, the movement of enzyme molecules and substrate molecules increases. This causes more collisions between enzyme and substrate and the net result is the formation of more product. If the temperature rises beyond a certain point, however, the enzyme activity eventually levels out and then declines rapidly because the enzyme is denatured by heat. The enzyme shape change during denaturation and can not catalyze the reaction and there is shape drop in the rate of the reaction with change in temperature. The effect of pH on Enzyme Activity A change in pH can also effect enzyme activity. Each enzyme has an optimal pH range that help maintain its normal configuration in an environment which it operates. Pepsins is a proteolytic enzyme found in the stomach and functions at pH 2. At pH 2 the tertiary structure of pepsin is not altered and will catalyze the reaction. Trypsin is and enzyme found in the small intestine and prefer a pH of about 8. The tertiary structure of a protein depends on interactions such as hydrogen bonding, between R groups. A change in pH can alter the ionization of these side chains and disrupt the normal configuration and in some case denature the enzyme. A denatured protein can not combine with a substrate. Andamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi: si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame ES si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone l’affinità per S si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del complesso ES Gli effetti 2 e 3 influenzano la KM il 4 la Vmax. La velocità aumenta all’aumentare di T, ma nella catalisi enzimatica un aumento di T può portare ad una variazione di conformazione con perdita conseguente dell’attività catalitica. Di solito si ha un max di attività tra 40°C e 60°C e la denaturazione completa a 90-95 °C.

Influenza della temperatura   Lo studio attività/temperatura permette di calcolare dall’equazione di Arrhenius K=A e-Ea/RT dalla cui linearizzazione si possono calcolare: Ea (molto + basso nelle reazioni enzimaticamente catalizzate) Q10= coefficiente termico ovvero fattore di cui aumenta la velocità quando T aumenta di 10°C. Reazioni non catalizzate Q10= 2 Reazioni catalizzate 1<Q10< 2

Influenza del pH Andamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi: si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame ES si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone l’affinità per S si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del complesso ES Gli effetti 2 e 3 influenzano la KM il 4 la Vmax.  

Fattori che influenzano la velocità di reazione Temperatura pH Concentrazione dell’enzima Concentrazione del substrato Nel caso di enzimi allosterici anche la presenza di modulatori positivi e negativi

Temperatura

pH

[E]

[S] Se mettiamo in grafico V in funzione di [S], troviamo che: A bassi valori di [S], la velocità V, aumenta quasi linearmente con l’aumentare di [S]. Ma come [S] aumenta, gli aumenti di V diventano via via più piccoli (iperbole rettangolare). L’asintoto rappresenta la velocità massima della reazione,Vmax La concentrazione di substrato che produce una V che è la metà di Vmax è detta costante di Michaelis-Menten, Km.

La maggior parte delle reazioni chimiche ha più substrati

REAZIONI CON PIU’ SUBSTRATI Reazioni sequenziali = reazioni con + substrati tutti presenti affinchè si abbia la liberazione di prodotti

Reazioni a ping-pong = prodotto liberato prima che tutti i substrati siano stati legati. S1 per primo si lega ad E che subisce una modificazione per sostituzione liberando il primo prodotto: poi l’enzima modificato si lega al secondo substrato S2 formando il secondo prodotto e liberando l’E nella forma originaria.

SISTEMI MULTIENZIMATICI Reagiscono in una serie consecutiva di reazioni in cui P diventa S della reazione successiva (azione concertata da 2 a 20 E di reazioni in sequenza).

INIBIZIONE ENZIMATICA Inibitori (I) =diminuiscono le velocità di reazione L’inibitore può legarsi all’enzima mediante legami: Fisici (inibizione reversibile) con l’allontanamento di I si ripristina l’attività di E Chimici (inibizione irreversibile) la formazione di legami covalenti impedisce il semplice allontanamento dell’I. 76

Inibitori enzimatici (piccole molecole o ioni) Irreversibili Reversibili Gli inibitori sono composti che interagendo con l'enzima ne riducono la sua velocità di reazione. Si trovano naturalmente nelle cellule, dove controllano la velocità di reazione dei processi metabolici, o introdotti artificialmente nei processi come strumenti sperimentali. Molti composti tossici sono inibitori enzimatici e perciò causano un'inibizione dei processi vitali complessivi. Il modo di interagire con l'enzima è estremamente vario e lo studio dei processi cinetici ci permette di delucidare i vari meccanismi.

INIBIZIONE REVERSIBILE Inibizione competitiva = I compete con S per il sito attivo di E Si può ridurre aumentando la [S]. Cambia KM non cambia Vmax Inibizione non competitiva = I si lega ad E in un sito diverso dal sito attivo. Si abbassa la Vmax ma non si modifica la KM Inibizione incompetitiva = I si lega solo al complesso ES. E + S  ES  E+P; ES+I  ESI Si modificano entrambe le costanti cinetiche.

Inibizione Competitiva Inibizione competitiva per formazione di legami col sito attivo. I è spesso simile al substrato e si lega al sito attivo dell’enzima impedendo al substrato di legarsi                                                                                                                                                                                          Da un punto di vista classico un inibitore competitivo è un composto che ha una stretta somiglianza strutturale e chimica col substrato. Questa somiglianza lo fa legare al sito attivo al posto del substrato. Un inibitore competitivo diminuisce la velocità della reazione perché riduce la frazione di molecole enzimatiche legate al substrato

Un inibitore competitivo ridurrà l'affinità enzima substrato, cioè aumenterà il valore di KM. Si può rimuovere aumentando [S]. Ad alte concentrazioni di substrato la reazione non viene rallentata e Vmax è sempre la stessa. 80

Alcuni inibitori competitivi sono farmaci molto utili. La sulfanilammide è un antibiotico contenente S strutturalmente identico all’acido p-amminobenzoico (PABA) un metabolita richiesto dai batteri per la sintesi dell’acido folico. La sulfanilammide si lega all’enzima che sintetizza la PABA e lo inibisce in modo competitivo inibendo la sintesi di acido folico. Altri inibitori competitivi sono le statine che inibiscono la sintesi del colesterolo

Inibizione non competitiva: inibitore e substrato si legano simultaneamente in siti diversi dell’enzima Inibizione competitiva per cambiamento di conformazione L'inibitore non si lega al sito attivo ma in un'altra zona dell'enzima tipica per quell'inibitore, che è localizzata in una porzione diversa dell'enzima stesso. Quando l'inibitore si lega causa un cambiamento della forma tridimensionale dell'enzima che ha come conseguenza una modificazione del sito attivo e la conseguente impossibilità per il substrato di legarsi ad esso. Gli inibitori non competitivi agiscono diminuendo il numero di turnover ma non agiscono sulla proporzione di molecole che legano il substrato

dell’enzima funzionale Il substrato può ancora legarsi al complesso EI oltre che all’enzima da solo. In ogni caso il complesso ESI non procede verso la formazione dei prodotti I                                                                                                                                                 La KM rimane invariata La Vmax diminuisce L’inibitore abbassa semplicemente la conc dell’enzima funzionale 83

Inibizione incompetitiva: l’inibitore si lega solo al complesso ES Il complesso ESI non procede verso la formazione di alcun prodotto. Il substrato non viene più convertito in prodotto. Un inibitore noncompetitivo si lega al suo sito sull'enzima, lontano dal sito attivo, causando un cambio nella conformazione del sito attivo stesso. In ciò è molto simile agli inibitori competitivi. La differenza sta nel fatto che il substrato si lega comunque al sito attivo ma esso non viene più convertito in prodotto come esemplificato dall'animazione.                                                                                                     Un classico inibitore non competitivo non ha influenza sulla capacità di legarsi del substrato all'enzima anche se il sito attivo è stato modificato nella sua forma, ma l'affinità sarà comunque ridotta. Questi inibitori misti noncompetititvi sembrano avere alcune prorpietà dei competitivi e dei non competititivi. Di fatto inibitori classici non competitivi sono rari, se esistono del tutto. Questi possono essere distinti dai competitivi per il loro effetto sui parametri cinetici.. L’inibizione incompetitiva non può essere rimossa da un eccesso di substrato

Inibizione non competitiva

Inibitori irreversibili Alcuni inibitori irreversibili sono farmaci importanti. La penicillina agisce modificando covalentemente l’enzima transpeptidasi e in questo modo la sintesi della parete batterica viene bloccata e i batteri tendono a morire. L’aspirina agisce modificando covalentemente l’enzima cicloossigenasi riducendo la sintesi dei segnali infiammatori

Gli inibitori irreversibili si combinano o distruggono un gruppo funzionale dell’enzima essenziale per l’attività catalitica. Es. Inibitori suicidi o inattivatori basati sul meccanismo che portano avanti le prime tappe della reazione enzimatica normalmente, poi invece di essere convertiti nel prodotto di reazione diventando composti molto reattivi che si legano irreversibilmente all’enzima.

specificità substrati reazioni complementarietà strutturale mutuo riconoscimento

modulazione dell’attività GLI ENZIMI REGOLATORI modulazione dell’attività quantità di proteina enzimatica regolazione

ENZIMI REGOLATORI Gli enzimi regolatori sono capaci di modulare la attività catalitica in risposta di certi segnali. Nei metabolismi possono lavorare insieme in modo sequenziale, ma almeno uno determina la velocità complessiva catalizzando la reazione più lenta (enzima regolatore). In molti sistemi multienzimatici il I enzima di ogni sequenza è un enzima regolatore.

Vi sono due classi di enzimi regolatori: Enzimi allosterici che agiscono mediante il legame reversibile di un metabolita chiamato modulatore Enzimi regolati mediante modificazioni covalenti reversibili

Queste due classi di enzimi sono proteine a struttura quaternaria che spesso non hanno sulla stessa subunità sito attivo e sito regolatore. Quando il substrato si comporta da modulatore l’enzima è detto omotropico se si tratta di molecola diversa eterotropico

Gli E regolatori non seguono il modello di Michaelis e Menten con andamento a sigmoide invece che iperbolico della curva Vo –[S] dovuto a interazioni cooperative tra le subunità dell’E.

ENZIMI NEL TERRENO   Sono prevalentemente liberi ed extracellulari e possono rimanere stabili ed attivi per migliaia di anni. Nel suolo esiste attività catalitica inorganica ed enzimatica, ma quest’ultima è molto più efficiente e eliminabile con trattamenti termici energici (110-150 °C per 15-30 h per una distruzione totale)

Nel suolo 4 classi di E: Ossidoreduttasi Idrolasi Liasi Transferasi La prime due sono predominanti Polisaccaridasi e proteinasi (idrolasi) demoliscono macromolecole come carboidrati e proteine e sono essenziali per i cicli biologici di C e N. Fosfatasi e solfatasi (idrolasi extracellulari) producono P e S nutrienti per le piante. Altre idrolasi demoliscono fitofarmaci e xenobiotici. Deidrogenasi (ossidoreduttasi intracellulari) danno informazioni sull’attività biologica delle popolazioni microbiche.