Terapia genica -malattie infettive -tumori -malattie ereditarie -malattie del sistema immunitario Terapia genica classica: Produrre la sostanza che manca al paziente Eliminare direttamente le cellule malate Attivare le cellule del sistema immunitario favorendo così l’uccisione delle cellule malate Terapia genica non convenzionale: inibire l’espressione dei geni coinvolti nella patogenesi, o di correggere un difetto genetico e quindi restaurare la normale espressione genica.

Non e` utilizzabile nella Sperimentazione Clinica

TERAPIA GENICA Tecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule somatiche di un paziente Scopo: • Correggere un difetto genetico • Fornire una nuova funzione alla cellula Applicabilità: 1. Malattie genetiche classiche (un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana) 2. Malattie multigeniche (cancro) 3. Malattie genetiche acquisite (AIDS) 4. Malattie non genetiche 80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4

Terapia genica in vivo ed ex vivo In vivo: in situ

Trapianto di cellule geneticamente modificate: Terapia genica EX VIVO Trapianto di cellule geneticamente modificate: • Estrazione/preparazione delle cellule primarie o di linea • Trasferimento del gene in vitro • Reimpianto delle cellule Problemi: • Cellule autologhe ingegnerizzate: laboriosa, vita limitata • Cellule eterologhe ingegnerizzate: reperibilità, compatibilità In vivo: in situ 5

TERAPIA GENICA IN VIVO Somministrazione diretta del gene terapeutico in vivo alle cellule: • iniezione diretta (ad es. nel muscolo scheletrico distrofico) • somministrazione in prossimità del tessuto (ad es. vie respiratorie nella fibrosi cistica) Problemi: • Trasferimento quantitativamente limitato • Rischio di inserimento in cellule sane • Reazione immunitaria

Geni integrati nei cromosomi (retrovirus) Geni non integrati (necessità di trattamenti ripetuti) (adenovirus)

Possibile effetto citopatico VETTORI VIRALI Vettore virale Vantaggi Svantaggi Retrovirus Capacità d'inserimento del gene, integrazione stabile nel DNA dell'ospite, elevati titoli di virus ricombinante, ampio tropismo d'infettività, relativa facilità di manipolazione del genoma virale Difficoltà nel controllare l'infezione virale, mancata infezione delle cellule non in divisione, integrazione a caso nel genoma dell'ospite Lentivirus Infezione delle cellule in divisione o meno, espressione stabile del gene, elevata capacità d'inserimento Mutagenesi potenziale presenza di sequenze proteiche regolatrici e accessorie Adenovirus Elevati titoli di virus, alta espressione genica, grande capacità d'inserimento, infezione di cellule in divisione e non in divisione Risposte immuni alle proteine virali, nessuna integrazione nel genoma dell'ospite, espressione genica transitoria Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, bassa immunogenicità e non patogenicità Limitate capacità per i transgeni, difficile generazione di alti titoli virali, presenza di adenoviruds o herpevirus per la moltiplicazione dei virus adeno-associati Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta capacità d'inserzione, tropismo naturale per le cellule neuronali, seguita dalla produzione di alti titoli virali Possibile tossicità, rischio di ricombinazione, nessuna integrazione virale nel DNA dell'ospite Poxvirus Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi framenti di DNA, alti livelli di di espressione transgenica,, seguita da virus vivo ricombinante Possibile effetto citopatico Virus di Epstein-Barr Infetta cellule in divisione o meno con prevalenza per i linfociti B, alta capacità d'inserimento Difficoltà di controllare le linee cellulari

Vantaggi dei vettori non virali Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo Svantaggi dei vettori non virali Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale Vantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

Gli adenovirus penetrano nelle cellule con un meccanismo di endocitosi mediata dai recettori

Recapito di geni mediato dai liposomi in vivo

Il trasferimento genico che utilizza l’endocitosi mediata da recettori

Inibizione mirata dell’espressione genica in vivo

PROBLEMI DELLA TERAPIA GENICA Stabilità d’espressione del transgene nel tempo 2. Mutagenesi inserzionale 3. Regolazione dell’espressione del transgene (promotori inducibili) 4. Cell targeting 5. Pericolosità, Etica

TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE GENETICHE CLASSICHE E’ importante stabilire se il processo citopatico risulta da: Loss of function del gene mutato, cioè la mutazione nel gene provoca perdita della funzione genica introduzione del gene normale OK Gain of function cioè la mutazione nel gene produce una proteina con funzioni diverse da quelle della proteina normale introduzione del gene normale INEFFICACE

Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA • Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato). • Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati). • Capace di incorporare DNA di varie dimensioni. • Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico • Non dovrebbe essere patogeno. • Amministrabile direttamente nel paziente. • In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio. • Ben tollerato. • Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune. • Facile da produrre in maniera riproducibile. IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’ UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE

Vettori Retrovirali: • Pro situazione attuale e prospettive future – efficiente trasduzione di cellule in attiva replicazione (linee tumorali) • linfociti e precursori delle linee ematopoietiche – notevole esperienza clinica ex vivo • Contro – integrazione random • attivazione di oncogeni • shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione – capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb) - Incapacità di infettare cellule in quiescenza (cellule nervose)

TERAPIA GENICA per deficit dell’ADA ADA (adenosina deaminasi): enzima coinvolto nel salvataggio delle purine nel percorso di degradazione degli acidi nucleici, indispensabile in molti tipi cellulari. La sua carenza causa una patologia recessiva molto rara che ha effetti molto seri sui linfociti T, una delle principali classi di cellule del sistema immunitario: GRAVE E COMPLESSA IMMUNODEFICIENZA ADA e TERAPIA GENICA: Il gene ADA è piccolo e clonato nel 1990 Le cellule bersaglio sono i Linfociti T, cellule facilmente ottenibili dal paziente e facilmente coltivabili TERAPIA GENICA EX-VIVO Livello di espressione puo’ variare senza conseguenze (range 10-5000&)

Struttura genomica ed espressione genica dei retrovirus Il genoma tipico contiene 3 “geni” Gag (componenti del core nucleoproteico) Pol (replicazione e ricombinazione) Env (componente della membrana esterna)

Genoma retrovirale Vettore retrovirale Lunghezza massima: 8Kb Trascrittasi inversa e integrasi Proteina strutturale capside Proteina per involucro Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside Lunga sequenza terminale ripetuta Vettore retrovirale Inserito nelle cellule eucariotiche con bassissima efficienza tramite trasfezione/elettroporazione Con alta efficienza Mediante INFEZIONE Lunghezza massima: 8Kb

Packaging cell lines Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione. Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

Dr. Sara Caldarola

Dr. Sara Caldarola

Dr. Sara Caldarola

Terapia con incremento delle copie geniche ex vivo per la deficienza di adenosina deaminasi (ADA) 1990

La modificazione genetica dei linfociti che infiltrano il tumore coltivati in vitro Può essere utilizzata per far esprimere geni “terapeutici” in un tumore solido

Terapia genica in vivo per i tumori cerebrali