Adenovirus

Adenovirus Virus che infettano svariate specie e tessuti Isolati per la prima volta nel 1953 da tessuto di adenoidi umane messe in coltura

Classificazione Famiglia Adenoviridae, genus Mastadenovirus 51 sierotipi isolati dall’uomo Adenoviruses sono ulteriormente classificati in 6 sottogruppi (A -F), in base alle proprietà emagglutinanti e alla omologia di DNA Patologie respiratorie: Sottogruppi B1,C,E Patologie oculari: Sottogruppi B,D,E Patologie intestinali (enteriti): Sottogruppo F (Sierotipi 40, 41) Patologie renali e urinarie: Sottogruppo B2

Capside icosaedrico 70-90 nm Genoma: DNA lineare a doppia elica ADENOVIRUS Struttura Virus senza envelope Capside icosaedrico 70-90 nm Genoma: DNA lineare a doppia elica Capside 252 capsomeri: 240 esoni, 12 pentoni La fibra (IV) media il contatto con il recettore cellulare, protrudendo dal pentone (III) Pentoni (III) ed esoni (II) Proteine minori del capside (VI, VIII, IX) Core V, VII, Mu, IVa2, TP (terminal protein) associate al DNA virale Proteasi importante per l’assemblaggio

STRUTTURA capside costituito da 252 capsomeri di cui 240 esoni (trimero prot II + VI, VIII e IX) e 12 pentoni (pentamero prot III + 5 prot IIIa) core contiene almeno 4 proteine (TP, V, VII, Mu) ESONI: Determinanti antigenici PENTONI: Attività tossina-simile FIBRE (trimeri proteina IV): mediano il riconoscimento dei recettori sulla superficie delle cellule permissive (CAR, integrine); sono responsabili dell’emoagglutinazione Il capside, che si assembla nel nucleo della cellula ospite, è formato da 252 capsomeri, dei quali 240 sono esoni, mentre 12 sono pentoni. La terminologia deriva dal fatto che gli esoni sono circondati da altre sei strutture mentre i pentoni da cinque. Gli esoni sono formati da un trimetro del polipeptide II con un poro al centro a cui sono associate le proteine minori VI, VIII e IX, la cui funzione è l’assemblaggio e la stabilizzazione della particella virale. La base dei pentoni invece è formata da un pentamero della proteina III, legato a cinque molecole di proteina IIIa, a cui si innesta una fibra (proteina IV) responsabile dell’emoagglutinazione. All’interno del capside il core avvolge l’acido nucleico che si presenta in forma lineare a doppia elica; le sue estremità sono tenute dalle proteine terminali TP necessarie per l’innesco della replicazione. Il nucleo della particella virale è formato anche dalle proteine simil istoniche VII e mu, ricche di lisine, che avvolgono il DNA carico negativamente. La proteina V fa da ponte tra il nucleo e il capside essendo legata sia al complesso DNA-proteine che alla proteina VI del capside. Il genoma adenovirale codifica inoltre per una proteasi (Pr) necessaria nel ciclo infettivo.   7

Adenovirus recettori principali Sottogruppo A (12,18,31)— proteina CAR (membro della superfamiglia delle Ig), funzione ignota, presente su molti tipi cellulari Sottogruppo B B1 (3,7,16,21,50) –CD46 (proteina regolatoria nel sistema del complemento), CD80, CD86 B2 (11,14,34,35) Sottogruppo C—CAR Sottogruppo D—acido sialico

Altre molecole importanti 1) Le fibre si legano ai due al recettore primario: ex a CAR (coxackie/adenoviral receptor) 2) I motivi RGD presenti nel pentone si legano alle integrine avb3 e avb5

Ciclo replicativo

FASI del CICLO VITALE DI ADENOVIRUS - Avviene nel nucleo delle cellule permissive (cellule di origine epiteliale), il ciclo ha una durata di circa 32-36 ore (ciclo litico) Un unico ciclo di replicazione è in grado di generare 10.000 virioni per cellula infettata; 1° fase 2° fase Il ciclo infettivo Il ciclo infettivo degli adenovirus si divide in due fasi e avviene La prima, o fase early, comprende l’entrata del virus nella cellula ospite e il passaggio del genoma virale nel nucleo, in seguito vengono espressi selettivamente i geni precoci. Gli eventi early modulano il metabolismo cellulare per favorire la produzione di nuovo DNA virale e l’espressione dei geni late. La seconda fase, dopo la trascrizione e la traduzione dei geni tardivi, è caratterizzata dall’assemblaggio nel nucleo cellulare di proteine strutturali e dalla maturazione di nuovi virioni. La fase early in cellule competenti dura circa 6-8 ore, mentre la fase tardiva è generalmente più rapida: circa 4 – 6 ore (13). Il tempo che intercorre tra l’infezione e la comparsa della prima progenie virale è detto periodo di eclissi. L’entrata dell’adenovirus all’interno delle cellule bersaglio è mediata dall’interazione della parte knob delle fibre del pentone con la porzione superficiale del recettore CAR, Coxsachie and adenovirus receptor (40). Si tratta di una proteina di membrana (46 kDa) che deriva dalla superfamiglia delle immunoglobuline ed è costituita da 3 domini: extracellulare, transmembrana e citoplasmatico. Gli adenovirus del gruppo B sembrano riconoscere un recettore diverso dal CAR (13, 51). È chiaro che il riconoscimento della cellula ospite, recettore-specifico, è alla base del tropismo degli adenovirus e di una loro internalizzazione più selettiva. Gli adenovirus di tipo 5 mediano la loro entrata anche attraverso un altro recettore, anch’esso appartenente alla superfamiglia delle immunoglobuline: si tratta del dominio α2 del MHC di tipo I (13). La presenza del recettore CAR non è necessaria per l’internalizzazione e il trafficking di Ad5, in grado di infettare cellule anche sprovviste del recettore specifico (51). Dopo l’iniziale interazione del virus con il recettore, l’entrata avviene attraverso un processo di endocitosi mediato da clatrina grazie al riconoscimento dell’RGD motif esposto nella base del pentone, unita all’interazione con le integrine cellulari (13). Gli adenovirus hanno sviluppato un sistema per rompere e per sfuggire dall’endosoma prima che questo acidifichi troppo entrando nel citoplasma della cellula ospite (51). Alcune proteasi codificate dal virus distruggono parte del capside virale (13) mentre la parte rimanente del virus viene trasportata alla membrana nucleare attraverso il sistema di microtubuli della cellula e il genoma virale entra attraverso i pori nucleari (51). A seguito di questo evento, hanno inizio la replica del materiale genetico e i primi eventi trascrizionali (39, 40). I geni sono trascritti su entrambi i filamenti e sono soggetti a numerosi eventi di splicing. Le regioni early trascritte sono E1, E2, E3, E4; i prodotti genici di E1 sono suddivisi in E1A e E1B. Il prodotto genico di E1A è un fattore di regolazione trascrizionale necessario per dar inizio alla trascrizione degli altri geni early. Il promotore MLP guida la trascrizione dei geni late: da L1 a L5; i geni tardivi codificano proteine strutturali e proteine dello scheletro. La traduzione dei geni strutturali e l’assemblaggio delle particelle virali avviene nel citoplasma e la loro formazione comporta la lisi della cellula, in quanto, la gemmazione è un evento compatibile solo per un numero limitato di virioni. Per ogni cellula infettata vengono prodotte circa 10.000 particelle 13

Fase di ingresso nella cellula

ADESIONE E ASSORBIMENTO CAR è una proteina di adesione che è espressa ad alti livelli: fegato, rene, cuore, cervello, pancreas, colon, prostata, endotelio CAR non è espressa in: linfociti periferici, milza, muscolo scheletrico e fibroblasti Adenovirus del gruppo B riconoscono un recettore diverso dal CAR (CD46) Adenovirus di tipo 5 riconosce come recettore anche il dominio α2 del MHC di tipo I Alcuni tumori in stadio avanzato perdono l’espressione del CAR (es. ovarico, colon...) Un dominio RGD esposto in un loop dei pentoni promuove l’interazione con le integrine promuovendo l’endocitosi Il colesterolo gioca un ruolo nell’uptake virale e fuoriuscita dall’endosoma 15

Penetrazione nella cellula Ingresso mediato da endocitosi clatrina-dipendente/pH dipendente Perdita delle fibre Lisi della membrana degli endosomi mediato dalla proteina della base dei pentoni A livello dei pori nucleari la struttura capsidica subisce un disassemblaggio parziale : - perdita dei pentoni III e della proteina IIIa - dissociazione della proteina VIII - degradazione proteolitica della proteina VI da parte della proteasi presente nel virione - perdita della proteina IX pH

Genoma degli adenovirus Il genoma è costituito da una molecola di DNA lineare a doppia elica di 30-40 kb, a seconda del gruppo preso in analisi. Alle estremità sono presenti le sequenze ITRs, inverted terminal repeats, che fungono da origini di replicazione e da promotori per alcuni geni. Vicino alla ITRs in 5’ vi è la sequenza segnale (sequenza Ψ) per l’inserimento del genoma all’interno del virione. I geni vengono espressi con una precisa sequenza temporale (immediate-early, early, late genes). I geni immediate-early sono E1A e E1B e servono ad innescare la replicazione nella cellula ospite. I geni early servono per la replicazione del genoma virale I geni late sono geni strutturali Il ciclo infettivo Il ciclo infettivo degli adenovirus si divide in due fasi e avviene La prima, o fase early, comprende l’entrata del virus nella cellula ospite e il passaggio del genoma virale nel nucleo, in seguito vengono espressi selettivamente i geni precoci. Gli eventi early modulano il metabolismo cellulare per favorire la produzione di nuovo DNA virale e l’espressione dei geni late. La seconda fase, dopo la trascrizione e la traduzione dei geni tardivi, è caratterizzata dall’assemblaggio nel nucleo cellulare di proteine strutturali e dalla maturazione di nuovi virioni. La fase early in cellule competenti dura circa 6-8 ore, mentre la fase tardiva è generalmente più rapida: circa 4 – 6 ore (13). Il tempo che intercorre tra l’infezione e la comparsa della prima progenie virale è detto periodo di eclissi. L’entrata dell’adenovirus all’interno delle cellule bersaglio è mediata dall’interazione della parte knob delle fibre del pentone con la porzione superficiale del recettore CAR, Coxsachie and adenovirus receptor (40). Si tratta di una proteina di membrana (46 kDa) che deriva dalla superfamiglia delle immunoglobuline ed è costituita da 3 domini: extracellulare, transmembrana e citoplasmatico. Gli adenovirus del gruppo B sembrano riconoscere un recettore diverso dal CAR (13, 51). È chiaro che il riconoscimento della cellula ospite, recettore-specifico, è alla base del tropismo degli adenovirus e di una loro internalizzazione più selettiva. Gli adenovirus di tipo 5 mediano la loro entrata anche attraverso un altro recettore, anch’esso appartenente alla superfamiglia delle immunoglobuline: si tratta del dominio α2 del MHC di tipo I (13). La presenza del recettore CAR non è necessaria per l’internalizzazione e il trafficking di Ad5, in grado di infettare cellule anche sprovviste del recettore specifico (51). Dopo l’iniziale interazione del virus con il recettore, l’entrata avviene attraverso un processo di endocitosi mediato da clatrina grazie al riconoscimento dell’RGD motif esposto nella base del pentone, unita all’interazione con le integrine cellulari (13). Gli adenovirus hanno sviluppato un sistema per rompere e per sfuggire dall’endosoma prima che questo acidifichi troppo entrando nel citoplasma della cellula ospite (51). Alcune proteasi codificate dal virus distruggono parte del capside virale (13) mentre la parte rimanente del virus viene trasportata alla membrana nucleare attraverso il sistema di microtubuli della cellula e il genoma virale entra attraverso i pori nucleari (51). A seguito di questo evento, hanno inizio la replica del materiale genetico e i primi eventi trascrizionali (39, 40). I geni sono trascritti su entrambi i filamenti e sono soggetti a numerosi eventi di splicing. Le regioni early trascritte sono E1, E2, E3, E4; i prodotti genici di E1 sono suddivisi in E1A e E1B. Il prodotto genico di E1A è un fattore di regolazione trascrizionale necessario per dar inizio alla trascrizione degli altri geni early. Il promotore MLP guida la trascrizione dei geni late: da L1 a L5; i geni tardivi codificano proteine strutturali e proteine dello scheletro. La traduzione dei geni strutturali e l’assemblaggio delle particelle virali avviene nel citoplasma e la loro formazione comporta la lisi della cellula, in quanto, la gemmazione è un evento compatibile solo per un numero limitato di virioni. Per ogni cellula infettata vengono prodotte circa 10.000 particelle 17

Il GENOMA degli ADENOVIRUS (ds DNA: 30-36 Kb) ITR SEQUENZE ITR (100bp) regione ORI (replicazione del genoma) regioni di controllo trascrizionale siti di legame per fattori trascrizionali e proteine enhancer cellulari : NF-I e Oct-I sequenza di impacchettamento

Rappresentazione schematica del genoma di adenovirus: ds DNA lineare di 36 kb Il genoma è di 30-40 kb, a seconda del gruppo preso in analisi. Alle estremità sono presenti le sequenze ITRs, inverted terminal repeats, che fungono da origini di replicazione e da promotori per alcuni geni. Vicino alle ITRs vi sono anche le sequenze Ψ per l’inserimento del genoma all’interno del virione. I geni vengono espressi con le sequenze immediately early, early, late; gli immediately early sono E1A e E1B e servono ad innescare la replicazione nella cellula ospite. Quelli early servono per la replicazione del genoma virale, mentre i geni late sono geni strutturali. Pur partendo da un genoma di piccole dimensioni, l’adenovirus codifica un elevato numero di prodotti genici: vi sono infatti molti geni sovrapposti e geni letti in senso inverso con porzioni sovrapposte e numerosi introni che, con splicing alternativo, danno origine a proteine diverse. La lunghezza dei geni varia con i siti di poliadenilazione. Ad esempio, i cinque trascritti late prendono origine da un promotore late MLP tripartito in L1, L2, L3 che origina diversi geni, a seconda del sito di poliadenilazione e della presenza o meno di introni (13). le regioni da E1 a E4 codificano i geni precoci (early) le regioni da L1 a L5 codificano i geni tardivi (late) Trascrizione bidirezionale mediata da RNA pol-II, si ottengono diversi mRNA grazie all’uso di diversi siti poli-A o per splicing alternativo 19

Rappresentazione schematica deli trascritti virali Il genoma è di 30-40 kb, a seconda del gruppo preso in analisi. Alle estremità sono presenti le sequenze ITRs, inverted terminal repeats, che fungono da origini di replicazione e da promotori per alcuni geni. Vicino alle ITRs vi sono anche le sequenze Ψ per l’inserimento del genoma all’interno del virione. I geni vengono espressi con le sequenze immediately early, early, late; gli immediately early sono E1A e E1B e servono ad innescare la replicazione nella cellula ospite. Quelli early servono per la replicazione del genoma virale, mentre i geni late sono geni strutturali. Pur partendo da un genoma di piccole dimensioni, l’adenovirus codifica un elevato numero di prodotti genici: vi sono infatti molti geni sovrapposti e geni letti in senso inverso con porzioni sovrapposte e numerosi introni che, con splicing alternativo, danno origine a proteine diverse. La lunghezza dei geni varia con i siti di poliadenilazione. Ad esempio, i cinque trascritti late prendono origine da un promotore late MLP tripartito in L1, L2, L3 che origina diversi geni, a seconda del sito di poliadenilazione e della presenza o meno di introni (13). Trascrizione bidirezionale mediata da RNA pol-II, si ottengono diversi mRNA grazie all’uso di diversi siti poli-A o per splicing alternativo 20

ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS geni precoci geni tardivi 50 proteine E- geni precoci L- geni tardivi

Regione E1: orientamento Indurre la cellula ospite ad entrare nella fase S del ciclo cellulare Sintetizzare i prodotti dei geni virali necessari per la replicazione del DNA virale Down regola l’espressione dell’MHC I (effetto immuno regolatore) L’espressione di E1A fa sfuggire al normale controllo da parte dell’interazione pRb-E2F Co-immunoprecipitazione di numerose proteine cellulari con la proteina E1A 22

Regione E2 suddivisa in 2 regioni trascrizionali separate: E2A ed E2B. orientamento suddivisa in 2 regioni trascrizionali separate: E2A ed E2B. la regione E2A codifica una proteina che lega ssDNA (DBP), altamente fosforilata nella regione N-terminale e richiesta per la replicazione del DNA: probabilmente funziona come  fattore di regolazione della trascrizione. la regione E2B codifica un precursore della proteina TP (80kDa) che viene convertita in una proteina di 55 kDa durante l’assemblaggio virale. Questa regione codifica anche una DNA polimerasi di 240kDa. 23

Regione E3 (“cell death protein”) codifica prodotti genici antiapoptotici e inibisce l’espressione di MHC facilita il rilascio delle particelle virali dalle cellule infettate, riduce la produzione di linfociti T citotossici E3 orientamento Promuove il rilascio del virus Funzione sconosciuta Funzione Sconosciuta Inibisce l’apoptosi Lega l’ MHC I Inibisce la trascrizione Inibisce l’apoptosi regolata da TNFa Agisce su NF-KB 24

Facilita la trasformazione Regione E4 (modula il metabolismo dell’ospite!) stimola lo sviluppo di una risposta umorale : aumentando IL6 e IL8 per la maturazione delle cellule B modula l’attività di trascrizione del virus inibisce la sintesi proteica dell’ospite. orientamento Modula l’attività di E2F Interagisce con E1B 55K agevolando la produzione degli mRNA Inibisce l’attivazione di E2F mediata da E1A Interagisce con E1B 55K Funzione sconosciuta Facilita la trasformazione 25

Replicazione del genoma La replicazione del DNA avviene grazie all’intervento di pTP, polimerasi virale, DBP che interagiscono con altre proteine cellulari Entrambe le estremità del genoma fungono da origini Protein priming and strand displacement model 26

ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI VA ITR E1A/B E2A/B E3 E4 ITR L1 L2 L3 L4 L5 unico trascritto viene processato per formare circa 18 mRNA con estremità 5’ identiche, divisi nei 5 gruppi L proteine strutturali proteine scaffold proteasi E1A MLTF L1 L2 L3 L4 L5 promotore MLP 52 kd IVa

GENI TARDIVI Proteine tardive = componenti strutturali del virione I geni tardivi sono trascritti a partire da un major late promoter (MLP) A partire da un trascritto primario di 29.000 nucleotidi, circa 18 specie di mRNA sono prodotte in seguito a splicing alternativi, tali mRNA sono stati raggruppati in 5 famiglie classificate da L1 a L5 che hanno porzioni 5’ variabili Altri RNA (VA) vengono generati dalla polimerasi III e si possono attribuire diverse funzioni a questi RNA: - regolazione degli splicing degli mRNA tardivi - controllo degli stadi della migrazione dei peptidi tardivi - inibizione degli effetti dell’INF mediante blocco del legame dei dsRNA alle proteine chinasi cellulari Rappresentazione di un modello delle strutture secondarie (dsRNA) che si generano a livello dell’Ad-tipo2 28

Assemblaggio degli adenovirus proteine singole (no poliproteina) ruolo critico della proteina L1 (funzione scaffold ?) citoplasma - formazione dei trimeri di proteina II (esoni). Funzione essenziale della proteina L4. nucleo - formazione dei pentameri di proteina III (pentoni) - formazione dei trimeri di proteina IV (fibre) formazione di capsidi vuoti

RILASCIO DEL VIRUS disaggregazione del citoscheletro della cellula ospite (L3 proteasi) E3 - death protein (meccanismo sconosciuto)

REPLICAZIONE E PATOGENESI Infezione delle cellule mucoepiteliali a livello del sito di ingresso ovvero della congiuntiva, del tratto respiratorio, gastrointestinale e genitourinario. Replicazione del DNA genomico intranucleare Fasi di replicazione precoci e tardive a cui segue l’assemblaggio e il rilascio dei virioni Danno diretto cellule mucoepiteliali ( tratto respiratorio, gastrointestinale, congiuntiva)

ADENOVIRUS INFEZIONE Tre tipi di infezione: Litica – cellule mucoepiteliali, porta alla morte cellulare Produzione di 10.000-1X106 virioni/cellula 1-5% dei virioni sono infettivi Latente / persistente – il virus permane in tonsille, adenoidi, placche di Peyers Scarsa produzione virale

ADENOVIRUS INFEZIONE Trasformazione oncogenica – crescita cellulare e replicazione senza morte cellulare. Integrazione del DNA Espressione costitutiva di geni E1A- E1B (importanti per immortalizzazione cellulare; inattivazione p53, Rb)

Patogenesi Molto diffusi Virus citolitici per effetto di accumulo dei virioni nel nucleo e per l’effetto citotossico di E3 (death protein) Infezioni acute del tratto respiratorio e in misura minore gastro-intestinale, possono dare cistiti emorragiche, miocarditi e cheratocongiuntiviti Molte infezioni sono subcliniche 34

ONCOGENESI Soltanto alcuni sottogruppi di adenovirus possono indurre direttamente la formazione di masse tumorali nel topo: Adenovirus del gruppo A (Ad12, Ad18,..) sono altamente oncogenici, e producono il tumore nella quasi totalità dei topi nell’arco di 4 mesi; Adenovirus del gruppo B (Ad3, Ad7,..) sono debolmente oncogenici, inducono il tumore in 4-18 mesi. Adenovirus del gruppo C e E non sono stati mai visti implicati nella induzione di tumori nell’animale. 35

g MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE E1A a b E1A E1B IB NF-kB E1B p53 CAR integrine E1A pRB geni proliferativi IKK g a b IB NF-kB risposta innata E1A E1B 19kd E1B 55kd p53 geni pro-apoptotici

ADENOVIRUS TRASMISSIONE Aerosol Contatto diretto Oro-fecale Eliminazione intermittente Aree affollate Diffusione mondiale Diffusione interumana

ADENOVIRUS INFEZIONE Adenovirus replica nei tessuti linfoide-associati, la viremia puo’ causare infezione secondaria in organi viscerali. La replicazione del virus causa un eccesso di componenti antigeniche liberate nel sovranatante come antigeni solubili. Colorazione basofila intra-nucleare corpi inclusi nelle cellule.

Adenovirus Immunita’ Infezioni controllate dalla risposta immunitaria Risposta anticorpale e T cellulare

Manifestazioni cliniche Infezioni subcliniche nella maggior parte dei casi Infezione primaria avviene nell’infanzia Tipi 1,2,5,6 tipicamente isolati dal tessuto adenoide o tonsille dei bambini Isolato dalle feci 5% malattie neonato, 3 % tra i 2-4 anni di vita Frequente nelle caserme

Manifestazioni cliniche Patologie respiratorie: Riniti, faringiti (con o senza febbre), tonsilliti, bronchiti, pertosse-simile, polmoniti Patologia oculare: cherato-congiuntiviti Patologie renali e urinarie: cistite emorragica, orchite, nefrite

Manifestazioni cliniche Patologia intestinale (gastroenteriti): diarrea per periodo più lungo che con altre infezioni virali, adeniti mesenteriche, epatiti, appendiciti (sierotipi 40,41,42) Patologie più rare nell’individuo immunocompetente: Meningiti, encefaliti, artriti, rash cutaneo, mioocarditi, pericarditi: Infezioni molto grave (o riattivazione infezione latente) in pazienti immunocompromessi

RIASSUMENDO……….

Adenovirus Diagnosi Ricerca del virus: Metodi immunologici Metodi molecolari Isolamento colturale In campioni di sangue, secrezioni, tamponi nasali, tamponi oculari, feci, urine, liquor….