Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali Laurea in Biologia e Tecnologie Cellulari IL RUOLO DI UNA FAMIGLIA DI MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS THALIANA NELLO SVILUPPO Mario Larosa a.a. 2013/2014

Nel genoma di Arabidopsis 80 MAPKKK LA TRASDUZIONE DEL SEGNALE MEDIATA DALLA CASCATA DELLE CHINASI ATTIVATE DA MITOGENO (MAPK) È UN MECCANISMO ALTAMENTE CONSERVATO NEGLI EUCARIOTI Stimolo 20 MAPK Nel genoma di Arabidopsis 80 MAPKKK 10 MAPKK MAPKKK MAPKK MAPK Una tipica cascata di trasduzione del segnale mediata da chinasi è costituita dalle cosiddette “Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinases” (MAPKKK) , che vengono fosforilate a seguito della percezione di uno stimolo extracellulare. Le mapkkk una volta attive che hanno come bersaglio della fosforilazione le “Mitogen-Activated Protein Kinase Kinases” (MAPKK) che a loro volta attivano le chinasi singole MAPK. Il passaggio del fosfato è un evento che porta all’amplificazione dello stimolo e generalmente determina l’attivazione di fattori di trascrizione implicati nella crescita e sviluppo o nell’immunità. in Arabidopsis come in lievito alla percezione del danno alla parete cellulare viene attivata una cascata di segnalazione mediata dalle MAP chinasi. Subito a valle dello stimolo sono attivate le cosiddette MAPKKK che hanno come bersaglio della fosforilazione le MAPKK che a loro volta attivano le chinasi singole MAPK. Questo meccanismo è altamente conservato e nelle piante è fondamentale nel regolare l'immunità innata, la divisione cellulare, l’integrità della parete, quindi la crescita e lo sviluppo delle piante. Crescita e Sviluppo Immunità

LE MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS In Arabidopsis thaliana le MAPKKK sono suddivise in tre sottofamiglie, la sottofamiglia MEKK, la sottofamiglia CDC e la sottofamiglia RAF. Fra le MEKK figura la famiglia genica ANP, su cui mi sono concentrato durante la mia tesi (Adattata da Champion et al., 2004) 3

LA FAMIGLIA DELLE “ARABIDOPSIS NPK1-RELATED PROTEIN KINASE” (ANP) La famiglia genica ANP è costituita da tre membri: ANP1, ANP2 ed ANP3 Sono stati identificati per la loro omologia con NUCLEUS– AND PHRAGMOPLAST-ASSOCIATED PROTEIN KINASE1 (NPK1) di tabacco Sono ridondanti funzionalmente: singoli mutanti knockout (KO) non differiscono dal WT, mentre solo il doppio KO anp2 anp3 mostra evidenti difetti nello sviluppo e nella citochinesi La famiglia di MAPKKK ARABIDOPSIS NPK1-RELATED PROTEIN KINASE (ANP) è costituita da ANP1, ANP2 ed ANP3. Le ANP sono state identificate per la loro omologia di sequenza con la MAPKKK di tabacco NPK1 (NUCLEUS- AND PHRAGMOPLAST-LOCALIZED PROTEIN KINASE 1), la quale si localizza nel fragmoplasto ed è coinvolta nella formazione della piastra cellulare e nella citochinesi oltre che nell'immunità mediata da effettori. Il ruolo in Arabidopsis della famiglia genica ANP non è ancora del tutto chiaro. I singoli mutanti omoziogoti per gli ANP sono normali, per via della ridondanza funzionale presente tra i membri della famiglia genica. Tuttavia doppi mutanti knockout ottenuti silenziando combinazioni di ANP diversi portano a fenotipi con alterazioni differenti dello sviluppo (come cellule bollose e binucleate, radici aberranti), suggerendo un coinvolgimento di questa famiglia nella citochinesi. Non sono mai stati ottenuti mutanti knockout omozigoti per tutti i membri della famiglia, né sono stati ottenuti doppi mutanti omozigoti ed in eterozigosi per il terzo membro della famiglia, suggerendo come ANP1, ANP2 ed ANP3 siano collettivamente essenziali allo sviluppo della pianta. Il triplo mutante KO è letale: le ANP sono COLLETTIVAMENTE ESSENZIALI nello sviluppo della pianta (Adattata da Krysan et al., 2002)

TRIPLI MUTANTI CONDIZIONALI anp Silenziamento genico mediato da microRNA artificiali (amiR) inducibili da β-estradiolo DMSO β-estradiolo (µM) 0.05 1 5 10 Wt pri-amiRANP1 espresso nel doppio KO anp2 anp3 amiR1 (fenotipo alterato nello sviluppo) DMSO β-estradiolo (nM) 2.5 5 10 20 pri-amiRANP3 espresso nel doppio KO anp1 anp2 Per risolvere il problema della letalità del triplo mutante knockout nel mio laboratorio sono stati precedentemente generati tripli mutanti condizionali, nei quali il terzo membro della famiglia genica è stato silenziato utilizzando microRNA artificiali (amiRNA) espressi in maniera inducibile e modulabile ponendo i pri-miRNA generati per silenziare l‘mRNA di ANP1 o ANP3 rispettivamente nel doppio mutante anp2 anp3 o anp1 anp2, sotto il controllo di un promotore inducibile da β-estradiolo. Come potete notare nella figura i tripli mutanti seguono una cinetica di dose effetto se cresciuti in presenza di b estr, l’induttore del mir. All’aumentare della concentr dell’induttore potete notare che i difetti nelllo sviluppo della pianta sono sempre più evidenti, in particolar modo per quanto riguarda l’allungamento della radice. In più abbiamo notato che la radice dei tripli mutanti presenta bollosità cellulare, come potete vedere nell’ingrandimento. Questo ci ha fatto supporre dei possibili danni alla parete cellulare vegetale che… L’efficacia degli amiRNA utilizzati per il silenziamento dei due trascritti è dimostrata dal fatto che in entrambi i tripli mutanti condizionali generati in background diversi, dopo il trattamento con estradiolo, mostrano lo stesso fenotipo. Questo suggerisce una alterazione della parete cellulare amiR3 (fenotipo normale) 5

LA PARETE CELLULARE VEGETALE Componenti microfibrillari Cellulosa La parete primaria è costituita da: Emicellulose Componenti matriciali Pectine QUESTA è COMPOSTA DA due componenti principali: una microfibrillare ed una matriciale amorfa. Le microfibrille sono costituite da cellulosa, composta da catene lineari di residui di D-glucosio uniti da legami glucosidici α(1→4) disposte parallelamente. Nella matrice si possono distinguere emicellulose, pectine e proteine. Le emicellulose sono un gruppo eterogeneo di polisaccaridi (xilano, glucomannano, mannano, galattomannano, arabinano e xiloglucano) che si associano mediante legami idrogeno alle microfibrille di cellulosa legandole tra loro per formare una rete. Le pectine sono anch’esse un gruppo eterogeneo di polisaccaridi, caratterizzato dalla presenza di uno zucchero acido come l’acido galatturonico e di zuccheri neutri come ramnosio, galattosio e arabinosio. Altri composti tipici della parete secondaria sono la lignina, le cere, le cutine e le suberine. (Adattata da Malinovsky et al., 2014b)

Enzimi litici rilasciati da un patogeno durante l’infezione STRESS BIOTICI E ABIOTICI POSSONO ALTERARE L’INTEGRITÀ DELLA PARETE CELLULARE IN ARABIDOPSIS THALIANA Un danno alla parete cellulare (Cell Wall Damage, CWD) può essere causato da: Enzimi litici rilasciati da un patogeno durante l’infezione Stress fisici L’INTEGRITà DELLA PARETE CELLULARE Può ESSEREALTERATA DA LEGGI TITOLO,IL DANNOP ALLA PARETE CELLULA LEGGI AD ESEMPIO (ELENCA), AD OGGI NONOSTANTE SIA STATA POSTULATO UN MECCANISMO E SORVEGLIANZA DELL’INTEGRITà STRUTTURALE DELLA PARETE IN ARABIDOPSIS NON SONO NOTI GLI ELEMENTI CHE LO COMPONGONO. MENTRE (Adattata da Szymanski e Cosgrove, 2014) (Adattata da Bellincampi et al., 2014) Agenti chimici

IL MECCANISMO DI MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ DELLA PARETE CELLULARE IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE La cascata delle MAPK media la segnalazione attivata dalla percezione del danno alla parete nel lievito Al contrario i meccanismi di mantenimento dell’integrità della parete cellulsare sono ben studiati in molteplici organismi ed attualmente la cascata di risposta al CWD maggiormente caratterizzata è quella di Saccharomyces cerevisiae. In lievito esistono sia meccanismi diretti (alterazioni nella parete cellulare e nella pressione di turgore) che indiretti (tramite attivazione di un complesso di canali del calcio localizzato sulla membrana che regola livelli intracellulari di calcio). Fra i meccanismi principali vi è quello diretto basato sulla percezione operata da varie proteine che fungono da sensori, Wsc1-3 (cell Wall integrity and Stress response Component1-3), Mid2 (Mating pheromone-Induced Death2), Mtl1 (Mid-Two Like1) e che attiva tramite RHO GTPasi una trasduzione del segnale mediata dal modulo delle MAPK. (Adattata da Levin, 2011)

OBIETTIVO DELLA TESI Caratterizzazione del ruolo delle ANP nello sviluppo della radice e nel mantenimento dell’integrità della parete cellulare di Arabidopsis thaliana Alla luce di quanto detto sinora l’obiettivo della mia tesi è stato quello di caratterizzare in Arabidopsis il ruolo della famiglia genica ANP nello sviluppo DELLA RADICE E DELL’ANALISI DI UN LORO POSSIBILE COINVOLGIMENTO NEL MANTENIMENTO DELL’INTEGRITà DELLA PARETE CELLULARE DI ARABIDOPSIS 9

Plantule di sette giorni LA MANCANZA DELLE ANP PROVOCA L’ESPANSIONE CELLULARE RADIALE NELLA RADICE Wt 1 μM β amiR3 DMSO amiR3 20 nM β amiR1 1 µM β Inizialmente ho focalizzato la mia attenzione sul fenotipo della radice in cui la mancanza di funzione delle ANP genera radici primarie e laterali più corte, con cellule rigonfie ed aumentando la dose di induttore il difetto si estende agli apici radicali compromettendo l’intero sviluppo della radice Plantule di sette giorni

Plantule di sette giorni LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI RISULTANO SIMILI A QUELLE DI PLANTULE WT TRATTATE CON L’ERBICIDA ISOXABEN (IXB) Wt 20 nM IXB amiR3 1 μM β Il fenotipo delle radici dei tripli mutanti anp è molto simile a quello osservato in plantule trattate con l‘erbicida IXB. Plantule di sette giorni

E’ un potente inibitore della biosintesi di cellulosa L’ISOXABEN È UN AGENTE MODELLO PER LO STUDIO DEL DANNO ALLA PARETE CELLULARE VEGETALE (N-[3-(1-Etil-1-metilpropil)-5-isoxazolil]-2,6-dimetossibenzamide) (Adattata da De Bolt, 2007) E’ un potente inibitore della biosintesi di cellulosa In letteratura, l’IXB è noto per essere un agente modello nello studio del CWD, e di esso si conoscono vari effetti a breve e lungo termine, che vi presenterò più avanti L’IXB è un potente inibitore della biosintesi di cellulosa. Tale biosintesi è mediata dalla cellulosa sintasi, un complesso a rosetta presente sulla membrana plasmatica e costituita dalle cosiddette proteine CESA (principalmente 1, 3, 6). Proprio le CESA sono bersagliate dall’IXB, che impedisce la sintesi della cellulosa nella parete cellulare. La somiglianza suggerisce che una alterazione della composizione parete cellulare sia responsabile del fenotipo dei tripli mutanti L’IXB induce il danno alla parete cellulare vegetale Differenti Cellulosa Sintasi A (CESA) sono bersagli dell’azione dell’IXB (Paredez et al., 2006) Piante trattate con IXB presentano un minore contenuto di cellulosa (Bischoff et al., 2009)

Radici di plantule di dodici giorni ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN Wt Wt β-estradiolo (1 μM) Wt IXB (20 nM) amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM) Radici di plantule di dodici giorni Alcohol-Insoluble Solid (AIS) Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione di Updegraff Analisi degli zuccheri totali AIS de-amilato Analisi Cellulosa cristallina Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid (ChASS) Analisi Pectine Per determinare le alterazioni della parete cellulare presenti nei tripli mutanti, ho analizzato il contenuto polisaccaridico e l’incidenza delle singole frazioni nella composizione della parete cellulare. Da plantule di dodici giorni trattate con estradiolo sono state prelevate le radici dal WT, dal WT trattato con IXB e dai tripli mutanti. Da queste ho estratto la frazione che rappresenta la parete cellulare totale, eliminando le componenti proteiche, degli acidi nucleici e dell’amido, e definita AIS deamilato. Di questa sono stati analizzati il contenuto degli zuccheri totali, la frazione pectica solubilizzata tramite trattamento con agenti chelanti, la frazion emicellulosica solubilizzata mediante trattamento con soluzioni basiche, ed ancora la cellulosa cristallina. La quantificazione della ellulosa cristallina è stata condota mediatnte PLC mentre le analisi del contenuto di zuccheri sono state effettuate tramite il saggio spetrofotomentrico Dubois. Residuo Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH Analisi emicellulose

g Zuccheri totali/mg AIS de-amilato * LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO ZUCCHERI TOTALI 200 400 600 800 1000 1200 1400 Wt IXB - + β amiR1 amiR3 g Zuccheri totali/mg AIS de-amilato * L’analisi degli zuccheri totali condotta sull’AIS de-amilato, tramite saggio Dubois basato sull’acido fenol-solforico, ha rivelato che sia le pareti cellulari dei tripli mutanti anp che quelle estratte dal WT trattato con IXB contengono meno polisaccaridi rispetto al WT a parità di mg di AIS de-amilato. Questo dato suggerisce che nella parete cellulare dei tripli mutanti e del WT trattato con IXB sia presente presenti altri componenti, tra cui molto probabilmente la lignina, come vedremo più avanti.

Radici di plantule di dodici giorni ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN Wt Wt β-estradiolo (1 μM) Wt IXB (20 nM) amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM) Radici di plantule di dodici giorni Alcohol-Insoluble Solid (AIS) Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione di Updegraff Analisi degli zuccheri totali AIS de-amilato Analisi Cellulosa cristallina Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid (ChASS) Analisi Pectine Per determinare le alterazioni della parete cellulare presenti nei tripli mutanti, ho analizzato il contenuto polisaccaridico e l’incidenza delle singole frazioni nella composizione della parete cellulare. Da plantule di dodici giorni trattate con estradiolo sono state prelevate le radici dal WT, dal WT trattato con IXB e dai tripli mutanti. Da queste ho estratto la frazione che rappresenta la parete cellulare totale, eliminando le componenti proteiche, degli acidi nucleici e dell’amido, e definita AIS deamilato. Di questa sono stati analizzati il contenuto degli zuccheri totali, la frazione pectica solubilizzata tramite trattamento con agenti chelanti, la frazion emicellulosica solubilizzata mediante trattamento con soluzioni basiche, ed ancora la cellulosa cristallina. La quantificazione della ellulosa cristallina è stata condota mediatnte PLC mentre le analisi del contenuto di zuccheri sono state effettuate tramite il saggio spetrofotomentrico Dubois. Residuo Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH Analisi emicellulose

LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO CELLULOSA CRISTALLINA RISPETTO AL WT 2 4 6 8 10 12 14 Wt amiR1 amiR3 (g glucosio mg-1 AIS de-amilato) Cellulosa cristallina β - + IXB ** * L’analisi della cellulosa cristallina effettuata ha evidenziato come, a parità di peso di AIS de-amilato estratto, nel WT trattato con IXB e nei tripli mutanti sia presente un minor contenuto di cellulosa cristallina rispetto al WT. Questa diminuzione è probabilmente responsabile dell’alterazione delle proprietà meccaniche della parete che portano al fenotipo cellulare aberrante visto poco fa nelle radici dei tripli e del Wt trattato con IXB

Radici di plantule di dodici giorni ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN Wt Wt β-estradiolo (1 μM) Wt IXB (20 nM) amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM) Radici di plantule di dodici giorni Alcohol-Insoluble Solid (AIS) Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione di Updegraff Analisi degli zuccheri totali AIS de-amilato Analisi Cellulosa cristallina Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid (ChASS) Analisi Pectine Per determinare le alterazioni della parete cellulare presenti nei tripli mutanti, ho analizzato il contenuto polisaccaridico e l’incidenza delle singole frazioni nella composizione della parete cellulare. Da plantule di dodici giorni trattate con estradiolo sono state prelevate le radici dal WT, dal WT trattato con IXB e dai tripli mutanti. Da queste ho estratto la frazione che rappresenta la parete cellulare totale, eliminando le componenti proteiche, degli acidi nucleici e dell’amido, e definita AIS deamilato. Di questa sono stati analizzati il contenuto degli zuccheri totali, la frazione pectica solubilizzata tramite trattamento con agenti chelanti, la frazion emicellulosica solubilizzata mediante trattamento con soluzioni basiche, ed ancora la cellulosa cristallina. La quantificazione della ellulosa cristallina è stata condota mediatnte PLC mentre le analisi del contenuto di zuccheri sono state effettuate tramite il saggio spetrofotomentrico Dubois. Residuo Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH Analisi emicellulose

* * Frazione emicellulosica Frazione pectica LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO PECTINE MA POSSIEDONO PIÙ EMICELLULOSE ESTRAIBILI CON KOH 0.1 M RISPETTO AL WT Frazione pectica Frazione emicellulosica 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 * 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 * 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 g Zuccheri ChASS/zuccheri totali g Zuccheri 0.1M KOH/zuccheri totali g Zuccheri 4M KOH/ zuccheri totali β + - - + - - + + - - + - + + - - + - + IXB - + - - - - - + - - - - La quantificazione delle pectine e delle emicellulose a parità di zuccheri totali estratti ha evidenziato come nei tripli mutanti e nel WT trattato con IXB vi sia una minor quantità di pectine, una maggiore quantità di emicellulose estraibili con KOH 0.1 M e una quasi inalterata quantità di emicellulose estratte con KOH 4 M. - + - - - - Wt amiR1 amiR3 Wt amiR1 amiR3 Wt amiR1 amiR3 Nella frazione emicellulosica estratta con KOH 4 M non ci sono differenze significative

LA SINDROME DA DANNO ALLA PARETE CELLULARE (CELL WALL DAMAGE SYNDROME - CWDS) IN ARABIDOPSIS La percezione del danno alla parete porta ad una serie di risposte come l’aumento di specie reattive dell’ossigeno (ROS), la deposizione ectopica di lignina e l’accumulo del fitormone acido jasmonico. Lignina IXB Cell Wall Damage ROS Acido jasmonico l’erbicida IXB è noto scatenare una serie di risposte secondarie (ROS, JA, lignina) conosciute nell’insieme come CWDS (Cell Wall Damage Syndrome), e visto che i tripli mutanti anp possiedono alterazioni della parete cellulari affini al WT trattato con IXB ho esaminato le risposte indotte dalla CWDS nei tripli mutanti (Adattate da Denness et al., 2011)

nmolH202/mg peso fresco /ml I TRIPLI MUTANTI MOSTRANO UN MAGGIORE ACCUMULO DI ROS EXTRACELLULARE ED UNA DEPOSIZIONE ECTOPICA DI LIGNINA 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 Wt amiR3 amiR1 1 µM β - + 0.08 0.09 nmolH202/mg peso fresco /ml 10 nM β DMSO Wt amiR3 20 nM IXB La produzione basale di ROS extracellulari prodotti è stata quindi analizzata sia nei tripli mutanti che nel WT. Come mostrato in figura le plantule dei tripli mutanti producono costitutivamente livelli più alti (rispetto al WT) di ROS extracellulari. Abbiamo inoltre osservato che tra i due doppi mutanti knockout, il doppio mutante anp2 anp3 mostra un livello maggiore di ROS in confronto al WT. Inoltre come sottolineano le figure nei tripli mutanti è stata riscontrata una deposizione ectopica di lignina, probabilmente generata come effetto compensatorio della alterazione della composizione della parete (come nel WT trattato con IXB)

I TRIPLI MUTANTI MOSTRANO UNA MAGGIOR ESPRESSIONE BASALE DEI GENI REGOLATI POSITIVAMENTE DALL’ACIDO JASMONICO Unità Arbitrarie (x10-3) 0.5 1.5 1 2 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 4 6 8 10 12 14 16 18 PDF1.2 ERF1 THI2.1 10 nM β - + amiR3 Wt Per valutare se nei tripli mutanti amiR3 fosse costitutivamente attivata la via di segnalazione mediata dal jasmonato, quale indicazione di un aumento dell’ormone è stata analizzata l'espressione basale di tre geni notoriamente regolati dal JA il gene THI2.1 (THIONIN2.1) ch codifica una tionina ed è specificamente regolata dal JA, e PDF1.2 (PLANT DEFENSIN 1.2) codifica una e il gene ERF1 (ETHYLENE RESPONSE FACTOR1) codifica un fattore di risposta all’ ormone etilene, anch’esso coinvolto nelle risposte agli stress,. Questi due geni sono indotti da JA ma anche dall’etilene. Nei tripli mutanti amiR3 l'espressione di tutti e tre i geni è risultata maggiore rispetto ai doppi mutanti anp1 anp2 (plantule di controllo amiR3 trattate con DMSO) e al WT

Cellulosa cristallina Pectine Emicellulose LA FAMIGLIA GENICA ANP È RICHIESTA PER IL MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ STRUTTURALE DELLA PARETE IN ARABIDOPSIS ANP Cellulosa cristallina Pectine Emicellulose Alterazione nella composizione della parete cellulare Diversi lavori hanno mostrato come la famiglia genica ANP è collettivamente essenziale al corretto sviluppo della radice in Arabidopsis in quanto il silenziamento dei suoi membri genera nel caso di mutanti superiore al singolo alterazioni nel fenotipo della radice con gravità crescente sino alla letalità nei tripli mutanti. Durante la mia tesi ho avuto modo di studiare tripli mutanti condizionali precedentemente generati nel mio laboratorio, verificando che il fenotipo, dato da cellule bollose ed espansione aberrante dell’apice radicale, è dovuto ad un complesso meccanismo scaturito dal danno alla parete. Tale danno è tipico anche nei trattamenti con IXB con cui i tripli mutanti condividono vari tratti. Tra le alterazioni che ho individuato nei tripli mutanti figurano un’alterazione nella composizione polisaccaridica e nelle frazioni della parete cellulare, l’attivazione costitutiva di risposte secondarie al danno della parete come la produzione di ROS, la deposizione di lignina e l’accumulo di JA e l’insensbilità dei tripli mutanti ko (mentre gli OE sono ipersensibili). Queste caratteristiche pongono le ANP al centro dei meccanismi di risposta al danno della parete, in quanto risultano essere le prime MPKKK richieste nel mantenimento dell’integrità della parete. CWDS ROS JA Lignina nella radice

IXB Cellulosa cristallina Pectine Emicellulose TALI ALTERAZIONI SONO MOLTO SIMILI AL TRATTAMENTO DEL WT CON L’ERBICIDA ISOXABEN IXB Cellulosa cristallina Pectine Emicellulose Alterazione nella composizione della parete cellulare Diversi lavori hanno mostrato come la famiglia genica ANP è collettivamente essenziale al corretto sviluppo della radice in Arabidopsis in quanto il silenziamento dei suoi membri genera nel caso di mutanti superiore al singolo alterazioni nel fenotipo della radice con gravità crescente sino alla letalità nei tripli mutanti. Durante la mia tesi ho avuto modo di studiare tripli mutanti condizionali precedentemente generati nel mio laboratorio, verificando che il fenotipo, dato da cellule bollose ed espansione aberrante dell’apice radicale, è dovuto ad un complesso meccanismo scaturito dal danno alla parete. Tale danno è tipico anche nei trattamenti con IXB con cui i tripli mutanti condividono vari tratti. Tra le alterazioni che ho individuato nei tripli mutanti figurano un’alterazione nella composizione polisaccaridica e nelle frazioni della parete cellulare, l’attivazione costitutiva di risposte secondarie al danno della parete come la produzione di ROS, la deposizione di lignina e l’accumulo di JA e l’insensbilità dei tripli mutanti ko (mentre gli OE sono ipersensibili). Queste caratteristiche pongono le ANP al centro dei meccanismi di risposta al danno della parete, in quanto risultano essere le prime MPKKK richieste nel mantenimento dell’integrità della parete. CWDS ROS JA Lignina nella radice

LE ANP SONO IMPLICATE NELLA RISPOSTA ALL’ISOXABEN 10 20 30 40 50 60 70 Wt anp1 anp2 anp3 % inibizione dell’allungamento della radice * 5 15 25 35 45 ANP1SE ANP3SE La somiglianza tra il fenotipo dei mutanti anp e quello delle plantule trattate con IXB suggerisce che le ANP possano essere coinvolti nella risposta all’Isoxaben. Sono andato quindi a vedere se i mutanti anp presentassero difetti di risposta all’erbicita. I miei risultati mostrano che nei abolendo la funzione di almeno due dei tre membri della famiglia genica, le plantule sono meno suscettibili al trattamento con l’erbicida, mentre, sovraesprimendo anche solo una delle tre proteine si osserva una maggiore sensibilità. Questo suggerisce che le ANP siano implicate nella risposta all’IXB. I doppi mutanti mostrano una minore sensibilità all’IXB al contrario dei mutanti sovraesprimenti le ANP, che risultano maggiormente sensibili all’erbicida

Le ANP sono richieste per la risposta al trattamento con l’IXB CONCLUSIONI La famiglia genica ANP è richiesta per il mantenimento dell’integrità strutturale della parete in Arabidopsis I tripli mutanti anp, al pari delle piante WT trattate con IXB, mostrano la sindrome da danno alla parete Le ANP sono richieste per la risposta al trattamento con l’IXB Alla luce di quanto visto, le analisi delle risposte tipiche della CWDS indotta da IXB studiate sui tripli mutanti evidenziano che entrambi sono caratterizzati da un maggiore accumulo di ROS extracellulari rispetto al WT; in entrambi è stata riscontrata una deposizione ectopica di lignina; sia i tripli mutanti anp che il WT trattato con IXB accumulano una maggiore quantità di jasmonato. Inoltre l’analisi di tripli mutanti ANP e di mutanti overesprimenti ANP ha dimostrato come queste siano richieste nella risposta indotta dall’IXB Le ANP sono le prime MAPKKK note per esser coinvolte nel mantenimento dell’integrità della parete cellulare vegetale

Caratterizzazione della localizzazione subcellulare PROSPETTIVE Tra i futuri obiettivi dello studio di questa famiglia genica figurano: Caratterizzazione della localizzazione subcellulare Identificazione dei loro diretti interattori Infine va ricordato quanto si sappia poco ancora sui meccanismi della risposta al CWD al mantenimento della CWI e sulla famiglia genica ANP, e di fatti in futuro si cercherà di capire meglio il ruolo di questa famiglia attraverso l’approfondimento dello studio sulle alterazioni causate dalla mancanza di funzione dei membri, la ricerca della corretta localizzazione e degli interattori diretti, ed infine la determinazione dell’esatto circuito regolativo dal momento della percezione dello stimolo ai bersagli finali della cascata di segnalazione. Grazie per l’attenzione