Cloning permette di avere DNA puro Dopo ligasi ho una miscela complessa di DNA difficile da purificare: Vettore non legato Frammento di DNA non legato Vettore richiuso senza inserzione del DNA (self-ligated vector) Vettore richiuso con inserzione di errato frammento di DNA Molecola ricombinante corretta E’ estremamente raro che una cellula incorpori più di una molecola di DNA Quindi ciascuna cellula produce una colonia di cellule tutte contenenti le stesse molecole di DNA (alcune il vettore corretto, altre quello self-ligated vector) Il punto diventa adesso identificare la colonia opportuna

Cloning permette di avere grandi quantità di DNA

“The uptake of DNA by bacterial cells” Le cellule sono capaci di prelevare DNA dal mezzo nel quale crescono. Il DNA acquisito può essere degradato oppure può sopravvivere e replicarsi nella cellula ospite. Nel caso di un plasmide, questo accadrà solo se il plasmide ha un origine di replicazione riconosciuta dalla cellula ospite. Cellule E. coli sono sensibili agli antibiotici ampicillina e tetraciclina Plasmide pBR322 sono resistenti a questi antibiotici “Uptake” di pBR322 può essere osservato perché cellule E. coli sono trasformate da ampicillina- e tetraciclina-sensibili (amp S tet S ) in ampicillina- e tetraciclina-resistenti (amp R tet R ) Attualmente, il termine trasformazione include l’uptake del DNA da parte di qualunque tipo di cellula

Trasformazione Solo poche specie batteriche (Bacillus, Haemophilus, Streptococcus) possono essere trasformate con facilità. Ma E. coli deve essere sottoposto a trattamento fisico e chimico che gli aumenta la capacità di introdurre DNA. Cellule che hanno subito questo trattamento si definiscono competenti.

La trasformazione, ovvero l’introduzione in cellule batteriche di DNA, può avvenire in 2 modi 1)Le cellule competenti sono sottoposte a breve riscaldamento in presenza del DNA plasmidico e cromosomiale da inserire. La resa della trasformazione e’ di circa colonie trasformate/  g di DNA plasmidico 2)Trattamento dei batteri in presenza del DNA plasmidico e cromosomiale da inserire con impulsi elettrici (elettroporazione). Questo metodo consente un’efficienza di colonie trasformate/  g di DNA plasmidico. Trasformazione

Il trattamento con CaCl 2 causa un cambiamento della membrana cellulare che incrementa il legame del DNA, ma non influisce sul introduzione del DNA nella cellula. L’innalzamento della temperatura per un periodo di tempo permette il trasferimento del DNA all’interno. La trasformazione di cellule competenti è una procedura poco efficiente (pochi DNA plasmidici entrano nelle cellule) E’ necessario un modo per distinguere le cellule che hanno effettivamente il plasmide

Trasformazione tramite elettroporazione: L’esposizione di cellule animali, vegetali e batteri ad impulsi elettrici ad alto voltaggio destabilizza la membrana cellulare ed induce la formazione transiente di pori che favorisce l’ingresso delle molecole di DNA. Tale metodo è rapido, semplice e efficiente. In genere l’efficienza di trasformazione è circa volte maggiore per cellule preparate tramite elettroporazione rispetto a quelle trattate chimicamente.

IMPORTANTE: L’espressione del gene di resistenza comincia subito dopo la trasformazione, ma ci vuole un po’ di tempo prima che molte copie dell’enzima che conferisce resistenza all’antibiotico si formino, quindi… Non “piastrare” le cellule subito dopo la trasformazione, ma prima metterle in un piccolo volume di mezzo liquido in assenza di antibiotico e incubarle per un breve periodo di tempo