Novità nella diagnostica Allergologica Luciana Indinnimeo Dipartimento di Pediatria e NPI

Iter diagnostico nell’allergia alimentare Diagnosi clinica basata su: - anamnesi rigorosa - E.O. con la presenza di un quadro clinico compatibile - test diagnostici in vivo e in vitro (Prick-test, Patch-test, IgE specifiche) che supportano il sospetto diagnostico ma vanno valutati nel contesto clinico - diagnostica molecolare - test diagnostico che prevede una dieta di eliminazione e un successivo test di provocazione: Test di Provocazione Orale (TPO) in doppio cieco controllato contro placebo (DBPCFC) è il gold standard per la diagnosi American College of Allergy, Asthma, & Immunology.Food allergy: a practice parameter. Ann Allergy Asthma Immunol 2006; 96:S1-68.

Microarray Tecnica di biologia molecolare originariamente sviluppata per studiare l’espressione dei geni delle cellule partendo dallo studio del mRNA. cavagni@opbg.net

Allergene Microarray La tecnologia del microarray rappresenta uno dei progressi più importanti in campo diagnostico allergologico degli ultimi anni e si avvale della sinergia tra nanotecnologie e la recente produzione di tutte le molecole allergeniche più comuni attraverso la tecnologia del DNA ricombinante. In pratica un pannello di molecole allergeniche ricombinanti o purificate vengono incubate con il siero del paziente in esame permettendo l’identificazione a livello molecolare del profilo anticorpale IgE del paziente stesso.

ALLERGOLOGIA MOLECOLARE Allergene Microarray Numerose singole molecole allergeniche ricombinanti (e non più miscele o estratti) Volumi di siero minimi (prelievo capillare) Volumi di reattivo minimi (riduzione costi) Facilita la verifica di diversi isotipi anticorpali Studio di specificità epitopiche distinzione tra polisensibilizzazione e cross-reazione Discriminazione tra allergeni maggiori e minori Immunoterapia specifica individualizzata sulla base della reattività a particolari epitopi (?)

Betulla verrucosa e panallergeni Termolabile, si associa ad OSA e a reazioni allergiche a frutta e vegetali nell’Europa del Nord CBP Le proteine Bet v 1 correlate sono potenti allergeni inalanti da polline di alberi dalla fioritura precoce dell’ordine botanico delle Fagales. Dopo sensibilizzazione primaria all’allergene del polline, la maggior parte dei pazienti tende a sviluppare sintomi allergici dopo ingestione di proteine omologhe Bet v 1 correlate presenti in un vasto range di frutta ( mela, pera ciliegia, kiwi, jackfruit), noci (nocciola) e vegetali( carota, sedano, prezzemolo). Le proteine PR-10 sono termolabili e instabili alla digestione da parte della pepsina Mothes N et al Int Arch Allergy Immunol. 2004 Dec;135(4):357-73 6 6

Bet v 2 = Phl p 12 = Mal d 2 mela= Cor a 2 nocciolo= Api g 4 sedano Bet v2-profilina Le profiline sono molto labili al calore ed alla digestione gastrica : i sintomi provocati dalla loro ingestione nei soggetti allergici si limitano nella gran parte dei casi alla sindrome orale allergica, indotta dagli alimenti crudi L’uso della profilina di una sola specie di pianta è sufficiente per testare la sensibilizzazione IgE vs la profilina, per la grande omologia e la cross-reattività IgE fra le profiline degli alimenti vegetali: le profiline di betulla (Bet v 2) e/o di coda di topo (Phl p 12) sono quelle più largamente usate. Bet v 2 = Phl p 12 = Mal d 2 mela= Cor a 2 nocciolo= Api g 4 sedano Jankiewicz A et al J Sci Food Agric 1997;75:359-70 7 7 7 7

Lipid Tranfer proteins (LTP) Sono veri panallergeni con variabile grado di crossreattività: 36 LTP agiscono come allergeni una volta ingeriti Fanno parte delle proteine di difesa delle piante contro l’attacco di batteri, funghi, virus e sono ubiquitariamente espresse in tutto il regno delle piante I più alti livelli di espressione sono stati rilevati nelle cellule periferiche associate con la parete cellulare e con la cuticola dei tessuti epidermici Per la loro resistenza alla digestione peptica e al calore sono considerati allergeni alimentari che possono causare gravi reazioni (allergeni alimentari di classe 1) Contrariamente alla famiglia delle PR-10 , gli LTP da pollini e frutta hanno una ridotta frequenza di omologia, perciò essi sono di rado implicati nella sindrome frutta-pollini infatti una cross reattività fra nsLTP fra pollini e piante alimentari è stata dimostrata solo per l’ Art v 3 dell’artemisia e il Prup 3 della pesca (Lombardero M et al Clin Exp Allergy 2004; 34:1415–142).Per la loro resistenza alla digestione peptica e al calore gli LTP sono considerati allergeni alimentari che possono causare gravi reazioni (allergeni alimentari di classe 1)Dopo ingestione, ma di rado anche inalazione o contatto possono manifestarsi: OAS ,sintomi gastrointestinali caratterizzati da violenti crampi intestinali fino all’orticaria angioedema e all’anafilassiL’allergia all’LTP può manifestrarsi a qualsieasi età Un rilevante numero di questi pazienti manifestano allergia alla frutta non collegata a pollinosi Una crossreattività degli LTP allergenici presenti negli alimenti è stata descritta anche fra specie botanicamente non correlateNon esistono studi longitudinali che dimostrino se i soggetti sono monosensibilizzati per tutta la vita o se svilupperanno sensibilizzazioni multiple entro questo gruppo di panallergeni La sensibilizzazione (rilievo di IgE specifiche) non implica allergia clinica (es sintomi da esposizione) infatti frutta o vegetali contenenti LTP dovranno essere evitati solo se compaino sintomi importanti dopo esposizione La concentrazione di LTP nella frutta varia in rapporto alla localizzazione della molecola.Sono stati riportati casi di pazienti che mangiano pesca sbucciata senza accusare I sintomi Al momento sono stati descritti 36 LTP che agiscono quali allergeni una volta ingeriti Radauer C et al JACI 2008:121:847-52 8 8 8 8

Allergia alla nocciola Proteine di deposito LTP 9 9 9

Un solo estratto, quante componenti ? Quale standardizzazione ? Quanti test da fare ? Allergene KD Der p 1 cysteine protease 25 Der p 2 14 Der p 3 trypsin 28/30 Der p 4 amylase 60 Der p 5 Der p 6 chymotrypsin Der p 7 22/28 Der p 8 glutathione transferase Der p 9 collagenolytic serine pro. Der p 10 tropomyosin 36 Der p 11 paramyosin 103 Der p 14 apolipophorin like prot. Der p 20 arginine kinas e 40* Dermatophagoides pteronyssinus European house dust mite Der p 1 antigen P1, cysteine protease 25 C 62, see list of isoallergens Der p 2 14 62A-C, see list of isoallergens Der p 3 trypsin 28/30 63 Der p 4 amylase 60 P 64 Der p 5 65 Der p 6 chymotrypsin 66 Der p 7 22/28 67 Der p 8 glutathione transferase 67A Der p 9 collagenolytic serine pro. 67B Der p 10 tropomyosin 36 Y14906 Der p 11 paramyosin 103 AY189697, 67C Der p 14 apolipophorin like prot. Epton p.c. Der p 20 arginine kinase 40* Thomas p.c. 10

Un esempio di Panallergene Proteina di 34-42 kd termostabile TROPOMIOSINA Proteina di 34-42 kd termostabile Presente in: - Crostacei: gambero, aragosta, granchio, gambero di fiume - Molluschi: ostrica, calamaro, lumaca - Nematodi: anisakis - Insetti: scarafaggio, cavalletta - Dermatofagoidi 11

103 cavagni@opbg.net 12

Diagnostica molecolare in vivo (SPT) SPT come molecole singole Pesca ,Noce, Kiwi SPT con molecole purificate Profilina (Pho d 2) Mal d 1 Polcalcina di palma da dattero 13 13 13

cavagni@opbg.net 14

Dieta di eliminazione e TPO GOLD-STANDARD: Dieta di eliminazione e TPO

Iter diagnostico nel sospetto di allergia alimentare SOSPETTA ALLERGIA ALIMENTARE ANAMNESI TEST CUTANEI IgE SPECIFICHE

Diagnostic Levels Negli ultimi anni Autori diversi hanno cercato di individuare valori del diametro del pomfo al di sopra dei quali il challenge può non essere eseguito in quanto certamente positivo. Sulla base del diametro del pomfo è possibile prevedere quando il TPO sarà certamente positivo ?

IgE (kU/L) Prick (mm pomfo) Valori di IgE specifiche e prick test oltre i quali il test di provocazione non è consigliato* Alimento IgE (kU/L) Prick (mm pomfo) Uovo 7 >5 – 7** Latte 15 >6 - 8** Arachidi 14 >4 – 8** Pesce 20 Soia 65 Grano 80 * La probabilità di reazione clinica al TPO è >95% . Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2001;107:891-6. ** Sporik R, Clin Exp Alllergy, 2000

Tests to assess the likelihood of obtaining a positive or negative OFC in children Serum levels of food-specific IgE antibodies and SPT wheal sizes are not absolute indications or contraindications to performing an OFC. Laboratory test results always have to be interpreted in the context of clinical history.

IgE specifiche e dimensione del ponfo allo SPT non possono predire la dose di alimento che induce la reazione e la gravità della stessa. Variabilità del cut off in funzione dell’età del bambino e del singolo allergene. Il limite di questo approccio è che la specificità del 100% che rende superfluo il challenge di conferma vale solo per pomfi di diametri così grossi (> 8 mm per il latte ecc) mentre si abbassa (ovvero compaiono falsi positivi cioè bambini SPT positivi ma che non reagiscono al challenge) se si considerano pomfi di dimensioni progressivamente inferiori. Inoltre, non sembra esservi relazione tra dimensione del pomfo e dose di alimento che induce la reazione e gravità della stessa.

a quale dose di alimento lo fa dopo quale intervallo di tempo .....pertanto nella larga maggioranza dei casi il diametro del pomfo non è una buona guida, solo il TPO può precisare: se il bambino reagisce a quale dose di alimento lo fa dopo quale intervallo di tempo gravità della reazione Pertanto a parte i casi limite con pomfi molto grossi, nella maggior parte dei casi solo il challenge può precisare se esista allergia clinica e di che gravità (guidando nella prescrizione dell’adrenalina autoiniettante)

Iter diagnostico nel sospetto di allergia alimentare SOSPETTA ALLERGIA ALIMENTARE ANAMNESI TEST CUTANEI IgE SPECIFICHE DIETA DI ELIMINAZIONE “DIAGNOSTICA” 2-4 settimane

Dieta di Eliminazione corretta identificazione dell’allergene dell’alimento sospetto Dieta oligoantigenica Dieta elementare Una volta sospettato che un alimento possa determinare una manifestazione allergica, è necessaria la sua completa eliminazione dalla dieta per 2-4 settimane (forme IgE mediate, colite, enterocolite) o fino a 3 mesi (malassorbimento, gastroenterite eosinofila etc) Il successo della dieta di eliminazione dipende da corretta identificazione dell’allergene possibilità di mantenere una dieta completamente priva dell’allergene altri fattori in grado di scatenare sintomi simili a quelli della allergia nel periodo di osservazione 23

Iter diagnostico nel sospetto di allergia alimentare SOSPETTA ALLERGIA ALIMENTARE ANAMNESI TEST CUTANEI IgE SPECIFICHE DIETA DI ELIMINAZIONE “DIAGNOSTICA” NESSUN MIGLIORAMENTO DIETA LIBERA

Iter diagnostico nel sospetto di allergia alimentare SOSPETTA ALLERGIA ALIMENTARE ANAMNESI TEST CUTANEI IgE SPECIFICHE DIETA DI ELIMINAZIONE “DIAGNOSTICA” NESSUN MIGLIORAMENTO MIGLIORAMENTO TEST DI PROVOCAZIONE ORALE SPECIFICO DIETA LIBERA POSITIVO DIETA DI ELIMINAZIONE “TERAPEUTICA”

Test di Provocazione Orale (TPO) Il TPO o, con il termine inglese, challenge, è una prova diagnostica, in vivo, che viene eseguita per confermare, in via definitiva, una preliminare e sospetta diagnosi di allergia alimentare.

TPO Aperto: medico e paziente sanno cosa si somministra; più utilizzato Cieco singolo: il medico sa cosa somministra, il paziente no; meno utilizzato Doppio cieco contro placebo (DBPCFC): sia il medico che il paziente ignorano cosa viene somministrato, gold standard per la diagnosi; poco utilizzato (nel 2008 in 6 centri allergologici italiani di terzo livello il DBPCFC è stato eseguito in 79 su 826 (9,5%) challenge effettuati)

Caratteristiche dei test di provocazione orale per alimenti in italia Caratteristiche dei test di provocazione orale per alimenti in italia. Studio retrospettivo multicentrico. Irene Berti et al. RIAP 2010 In Italia il TPO viene eseguito in meno della metà dei centri e di questi solo circa il 10% effettua il TPO in doppio cieco contro placebo.

TPO - Indicazioni Precauzioni Storia clinica di reazione avversa ad alimento (con o senza IgE specifiche) Storia poco suggestiva o assenza di riferita reazione avversa ad alimento ma: Bambino a dieta da tempo e IgE specifiche positive Sensibilizzazione verso alimento mai ingerito (uovo in lattanti) Crossreattività o co-sensibilizzazione verso proteine omologhe Precauzioni Sempre da eseguire sotto stretto controllo medico in ambiente con sicura e pronta disponibilità di strumenti e farmaci di emergenza (Adrenalina, Antistaminici, Cortisonici, β2 agonisti), Particolare attenzione va posta ai pazienti con test diagnostici in vitro di elevata positività Vanno forniti tutti gli elementi per ottenere dai genitori un consenso informato condiviso

Algoritmo per la diagnosi di Allergia Alimentare Calvani M. et al RIAP Ottobre 2009 Reazione allergica immediata Reazione allergica non immediata o sospetta componente psicogena TPO in aperto DBPCFC + con sintomi oggettivi + con sintomi soggettivi Negativo Positivo Negativo TPO in aperto Continua dieta DBPCFC Dieta libera Continua dieta Dieta libera

Flowchart outlining whether to perform oral challenges in an open or double-blind fashion. < 3 anni EAACI

TPO - Reazioni Reazione precoce: entro 2 ore dalla somministrazione dell’ alimento Reazione tardiva > 2ore Bisogna osservare e registrare i sintomi dopo 24 - 48 ore e dopo una settimana dal test

Treatment plan for allergic symptoms. Komei Ito and Atsuo Urisu. Diagnosis of Food Allergy Based on Oral Food Challenge Test. Allergology International. 2009

When should an oral food challenge be stopped When should an oral food challenge be stopped? In daily practice it makes sense to challenge until clear objective symptoms occur without doing harm to the patient by continuing to the maximum response. What can be used as criteria for objective symptoms? Clinical symptoms should be objective and/or: (a) severe or (b) reproducible or (c) persisting. A sensitive parameter for a beginning clinical reaction is a general change of demeanour Factor ‘time’ The sooner symptoms appear or are observed, the more likely a ‘true’ positive reaction is.

What are objective symptoms of the different organ systems? repeated severe vomiting crampy-like abdominal pain watery rhinitis stridor wheezing urticaria difference of at least 15 points of the SCORAD index for a positive eczematous reaction. lowered blood pressure tachycardia

Quando ripetere il TPO ? Il test di scatenamento orale può essere ripetuto periodicamente in caso di risultato positivo (3-6 mesi) Dopo 1 anno di dieta, nelle allergie alle proteine del latte vaccino IgE mediate Dopo 3 anni se c’è stata anafilassi L’acquisizione della tolleranza deve essere valutata con il TPO e non con gli SPT o con il dosaggio delle IgE specifiche

Comparisons of state anxiety in mothers before and after DBPCFC * Significant decrease of state anxiety before and 2 wk after DBPCFC, p < 0.01. † Significant decrease of state anxiety before and 3 months after DBPCFC, p < 0.01. ‡ Significant decrease of state anxiety before and 1 yr after DBPCFC, p < 0.01. § Significant decrease of state anxiety 2 wk and three months after DBPCFC, p < 0.01. Wieneke T. Zijlstra , et al. Parental anxiety before and after food challenges in children with suspected peanut and hazelnut allergy. Pediatr Allergy Immunol 2010

La diagnosi di allergia alimentare: deve essere sempre più basata su dati scientifici nessun singolo test è diagnostico si basa sull’eliminazione dell’alimento e successivo TPO ha un importante valore prognostico in considerazione del fatto che la sensibilizzazione ad alimenti può rappresentare un fattore predittivo del successivo sviluppo di sensibilizzazione allergica ai comuni areoallergeni.

La diagnosi di allergia alimentare è presupposto fondamentale per fornire informazioni adeguate alla famiglia, per evitare false malattie e/o stati di ansia che possono degenerare in isolamento o iperprotezione del bambino e per attuare una terapia corretta ed efficace.

Grazie per l’attenzione !