HPV: human papilloma virus Gruppo I ( Virus a DNA ) Nudo ( senza pericapside ) Genoma a DNA circolare ds

Genetica dei virus a dsDNA Trascrizione primaria, mediante l’uso di enzimi cellulari; Traduzione con produzione di proteine “precoci” (regolatrici ); Replicazione del DNA genomico virale da parte di enzimi della cellula ospite; Trascrizione tardiva per mezzo di enzimi virali; Sintesi di proteine “tardive” (strutturali); Assemblaggio delle proteine strutturali e del DNA nei nuovi virioni.

Le cellule bersaglio dell’HPV sono gli epiteli della cute e delle mucose, che si rigenerano in continuazione. A seconda del luogo dell’infezione si avranno dunque verruche nella cute e papillomi nelle mucose. Alcuni tipi di HPV possono causare, sia nell’uomo che nella donna, tumori benigni, quale il condiloma genitale, e anche maligni, quale il cancro al collo dell’utero, al cavo orale, all’ano, all’ esofago ed alla laringe. Gli HPV si contraggono tramite contatto diretto ( sessuale, orale e cutaneo). Non sono presenti in liquidi biologici quali sangue o sperma. Il virus è più frequentemente trovato tra le popolazioni promiscue e in condizioni precarie di igiene. L’uso del profilattico non ha azione protettiva completa in quanto l’infezione è spesso diffusa anche alla cute della vulva e del perineo. Le lesioni da HPV del collo uterino possono essere riconosciute mediante il Pap Test.

Genoma dell’ HPV 8 Open Reading Frames ( ORF ) 6 Proteine Precoci ( early proteins ) ( E1, E2, E4, E5, E6, E7 ) che servono a modificare il metabolismo della cellula ospite per metterlo al servizio dell’HPV. Infatti favoriscono la crescita e la divisione della cellula, dal momento che l’HPV può replicare il proprio genoma solo nelle cellule in replicazione, in quanto non codifica per una sua DNA polimerasi e ha bisogno della polimerasi della cellula ospite. 2 Proteine tardive o strutturali ( late proteins ) ( L1, L2 ) che associandosi tra loro formano la struttura icosaedrica del capside virale ( composto da 72 capsomeri ). Regione di controllo ( LCR ).

La proteina E2, è una proteina regolatrice, infatti se un DNA virale si dovesse associare ad un DNA cellulare con la rottura di zone che codificano per l’espressione di proteine regolatrici come la E2 si avrebbe una sovraespressione di oncoproteine come la E6 e la E7. Tra le oncoproteine E5, E6 ed E7, la proteina E5 è deputata a mantenere bassi i livelli dell’ MHCI, un complesso proteico che servirebbe alle cellule immunitarie T-cell al riconoscimento dell’ HPV, senza il quale la riproduzione procede senza intoppi immunitari. La proteina E6, è una proteina associata, che si lega con la p53, interferendo e annullandone le proprietà attivatore-repressore trascrizionale. Che se libera si attiverebbe in caso di danni al DNA per bloccare il ciclo cellulare riparando il DNA stesso, o innescando l’apoptosi per non diffondere la patologia. La proteina E7, una piccola fosfoproteina, si lega alla Rb, una proteina soppressore tumorale, destabilizzando il fattore trascrizionale della cellula e impedendo il blocco del ciclo cellulare.

TIPI DI HPV Circa 30 tipi infettano primariamente l’epitelio squamoso del basso tratto genitale, dando origine a: condilomi acuminati o verruche “a cavolfiore”, e “condilomi piani” (malattia subclinica) Gli HPV tipo 6, 11, 42, 43, o 44 di norma si presentano come condilomi acuminati, ma possono anche presentarsi come lesioni piane che possono o no essere visibili a occhio nudo: sono i tipi “a basso rischio” I tipi 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, e 56 sono considerati “ad alto rischio” essendo stati riscontrati nei carcinomi della cervice e altre neoplasie del basso tratto genitale

LESIONI “SUBCLINICHE” DA HPV VISIBILI DOPO INGRANDIMENTO E APPLICAZIONE DI ACIDO ACETICO

(popolazione femminile U.S.A. 1997) La Piramide di Koutsky (popolazione femminile U.S.A. 1997) 75%

la grandezza del problema EPIDEMIOLOGIA: la grandezza del problema Prevalenza mondiale femminile: 270.000.000 Ogni donna ha il 79% di possibilità di incontrare il virus nella vita Fattori di rischio ABITUDINI SESSUALI ETA’ IMMUNODEPRESSIONE CONTRACCEZIONE FUMO n. partners 20-30 Diabete orale Età p.r.: <17 aa Gravidanza HIV chemioterapia Trapianto d’organo

PREVALENZA DI HPV DNA Donne con citologia normale Tutte le età 4-10% Meno di 30 anni 25-35% LESIONI PREINVASIVE 80-90% CAMPIONI DI CANCRO CERVICALE 95-100%

MESSAGGIO CHIAVE Avere l’HPV non è sinonimo di un certo comportamento sessuale, di infedeltà o del momento in cui si è contratta l’infezione. HPV va considerato come un commensale e non come una malattia venerea Il cancro cervicale è una rara conseguenza di una comune infezione virale genitale

IL CICLO VITALE DELL’ HPV La natura transitoria della maggior parte delle infezioni da HPV è confermata dai dati che documentano che il numero di partners durante tutta la vita non è significativamente correlato con la positività all’HPV, in contrasto con il rischio associato con il numero di partners negli ultimi cinque anni.

DEFINIZIONE DI SCREENING “ L’esame di una popolazione asintomatica per selezionare i casi con alta probabilità di sviluppare o avere la malattia oggetto di screening” (Morrison, 1985) “L’esame di una popolazione asintomatica che consenta la identificazione del più iniziale stadio di sviluppo biologico e/o clinico del tumore in esame” (Burgarth, 1994)

REQUISITI STANDARD “agevole” per l’utenza ben tollerato bassi costi eseguito su tutta la popolazione asintomatica

STRUMENTI DISPONIBILI PAP test tradizionale PAP test “a strato sottile” HPV test HCR PCR

HPV-DNA testing: Hybrid Capture II 1 2 3 4 5 Rilascio e denaturazione degli acidi nucleici Ibridazione della sonda dell'RNA con il DNA bersaglio Cattura degli ibridi dell'RNA: DNA in una fase solida Reazione degli ibridi catturati con anticorpi coniugati multipli Rilevamento del segnale chemiluminescente amplificato Basso Rischio 6, 11, 41, 42, 43, 44 Rischio Intermedio 31, 33, 35, 39, 51, 52 Alto Rischio 16, 18, 45, 46 Sierotipi disponibili

HPV-DNA testing: Polymerase Chain Reaction costo più elevato sensibilità migliore tipizzare i diversi tipi di HPV DNA ESTRATTO BUFFER PRIMERS NUCLEOTIDI DNA-POLIMERASI ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO TERMOCYCLER 1 DENATURAZIONE 2 ANNEALING 3 POLIMERIZZAZIONE 2 VOLTE: Presenza DI HPV DNA Basso rischio o Alto rischio?

non screening per cancro ma diagnosi di MTS HPV-DNA testing: non screening per cancro ma diagnosi di MTS L’infezione da HPV rappresenta un fattore necessario ma non sufficiente nell’etiopatogenesi del cervicocarcinoma. Quasi tutti i tumori della cervice sono HPV+ ma la maggior parte delle donne HPV+ non svilupperà mai il tumore della cervice Gli attuali tests stratificano il rischio in base al genotipo virale (HR:16-18 LR:6-11), ma non in base all’attivita’ virale (J Clin Virol,2005)

INDICI DI RISCHIO PER CANCRO genotipo virale HR: HPV DNA TEST quantità DNA infettante stato fisico del virus (episomale-integrato) HPV OSPITE COFATTORI

INDICI DI RISCHIO PER CANCRO genotipo virale HR quantità DNA infettante stato fisico del virus (episomale-integrato) PCR-real time Carica virale

INDICI DI RISCHIO PER CANCRO genotipo virale HR quantità DNA infettante stato fisico del virus (episomale-integrato) Southern blotting E6-E7 nel DNA cellulare O Amplificazione m-RNA

La concentrazione di p16 è quindi un indice di rischio per K INDICI DI RISCHIO PER CANCRO La p16 è una chinasi capace di inibire il ciclo cellulare attraverso l’attivazione di un gene oncosoppressore (Rb). HPV attraverso l’integrazione di E7 è capace di inattivare Rb e di determinare una iperespressione cellulare di p16. La concentrazione di p16 è quindi un indice di rischio per K

HPV - Ruolo clinico in ginecologia Sangue con EDTA 2ml urine 5ml Liquido seminale 1ml Tampone cervicale Tampone vaginale Tampone vulvare Tampone orofaringeo In teoria HPV DNA può essere cercato su tutti i campioni biologici Screening Gestione ASC US Gestione LSIL,HSIL Follow up post trattamento In ambito clinico è stato approvato HPV DNA testing solo in patologia cervicale

HPV - Ruolo clinico in ginecologia

HPV - Ruolo clinico in ginecologia No uniformità protocolli gestione follow up post trattamento conservativo per CIN di alto grado NOSTRA PROPOSTA:

SENSIBILITÀ: CONFRONTO TRA SCREENING DELL’HPV E PAP TEST Lorincz, et al. Arch Pathol Lab Med. 2003;127:959-968.

VALORE PREDITTIVO NEGATIVO: CONFRONTO TRA SCREENING DELL’HPV E PAP TEST Lorincz, et al. Arch Pathol Lab Med. 2003;127:959-968.

SPECIFICITÀ: CONFRONTO TRA SCREENING DELL’HPV E PAP TEST Di solito, un aumento della sensibilità corrisponde ad una diminuzione della specificità. Tuttavia da questo grafico risulta solo una diminuzione marginale della specificità quando si utilizzano insieme il DNAwithPap test e l'esame citologico. Il risultato finale è che si ottengono molti vantaggi in termini di sensibilità con solo una perdita minima di specificità. Lorincz, et al. Arch Pathol Lab Med. 2003;127:959-968.

Circa una donna su sei con un test hc2 positivo svilupperà un’anormalità citologica rilevabile entro i 5 anni successivi. PE Castle, S Wacholder, ME Sherman, AT Lorincz, AG Glass, DR Scott, BB Rush, F Demuth, M Schiffman Cancer (2002) 95, 2145-2151

sensibilità pari o superiore VANTAGGI DELL’ HPV TEST RISPETTO AL PAP TEST COME STRUMENTO DI SCREENING PRIMARIO sensibilità pari o superiore capacità di individuare le donne a rischio di contrarre la malattia in futuro minori competenze tecniche richieste possibilità che le donne possano prelevare da sé i campioni.

JJ Kim, TC Wright, SJ Goldie. JAMA (2002) 287(18), 2382-2390 Per le donne con un risultato ASCUS allo screening biennale mediante esame citologico tradizionale o in fase liquida, il reflex test del DNA dell’HPV è meno costoso di un test dell’HPV ritardato, della ripetizione dell’esame citologico o della colposcopia immediata. Un programma di screening biennale che utilizzi un esame citologico in fase liquida e un test riflesso dell’HPV risulta inoltre più efficace e meno costoso dell’esame citologico annuale tradizionale con la ripetizione dell’esame citologico o la colposcopia. JJ Kim, TC Wright, SJ Goldie. JAMA (2002) 287(18), 2382-2390

LINEE GUIDA DI CONSENSO DELL’ASCCP1 Il reflex test per i tipi di HPV ad alto rischio è la strategia d’elezione per la gestione del Pap test anormale bordeline. Wright T, et al. JAMA, 2002;287:2120-2129.

ASCUS CYTOLOGY HPV test +High-Risk -High-Risk HPV HPV Colposcopy Repeat cervical cytology in 4-6 months

RACCOMANDAZIONI DELL’ACOG “L’impiego combinato di un esame citologico della cervice uterina e dello screening del DNA dell’HPV è adatto per le donne dai 30 anni in poi..” ACOG Practice Bulletin, Number 45, August 2003. Replaces Committee Opinion Number 152, March 1995.

PERCHÉ SOTTOPORRE AL TEST DELL’HPV SOLO LE DONNE DAI 30 ANNI IN POI? 15- 19 20- 24 25- 29 30- 34 35- 39 40- 44 45- 49 50- 54 55- 59 60- 65 HPV Prevalence (%) HPV (HC2) Cancer 5 10 15 20 25 30 Cancer incidence per 100,000 Age (Years) Le donne di età <30 anni presentano una maggior prevalenza di infezioni da HPV e più infezioni transitorie.1 La prevalenza dell’HPV diminuisce nelle donne a partire dal 30° anno di età.2,3 L’incidenza del cancro del collo dell’utero aumenta nelle donne a partire dal 30° anno di età.2,3 1)Saslow, D. et al. CANCER. 52(6) 342-362., 2)Melkert PW, et al. Int J Cancer, 1993;53:919-923. 3)NCI SEER Data, 1990-1994.

CARTA INTERNAZIONALE DI EUROGIN “L’età ideale per iniziare lo screening con l’esame citologico associato al test dell’HPV sono i 30 anni. Sottoporre a test le donne di età > 30 anni per gli HPV ad alto rischio è un metodo più efficace come screening primario rispetto all’esame citologico della cervice uterina attualmente praticato. Le donne positive all’HPV, ma con referto citologico normale, non devono essere sottoposte immediatamente a colposcopia salvo in presenza di altre valide indicazioni cliniche. La risposta clinica più adatta consiste nel ritestarle dopo 1 anno per verificare la persistenza dell’HPV. European Research Organization on Genital Infection and Neoplasia. April 2003 Conclusions: Cervical Cancer Control, Priorities and New Directions. International Charter.

LINEE GUIDA DELL’ACS1 “Il test del DNA dell'HPV presenta una maggior sensibilità rispetto all'esame citologico nel rilevare lesioni clinicamente rilevanti” e “l'elevato valore predittivo negativo derivante dallo screening concomitante con esame citologico e test del DNA dell'HPV DNA potrebbe consentire di allungare in sicurezza gli intervalli di screening, riducendo in questo modo i costi”. Saslow, D. et al. CANCER. 52(6) 342-362..

Poiché le donne con risultati negativi ad entrambi i test corrono un rischio molto basso, l’impiego del test dell’HPV consentirebbe di prolungare, in sicurezza e con un miglior rapporto costo-beneficio, l’intervallo di screening a cinque anni. (J-P Bory1, J Cucherousset, M Lorenzato, R Gabriel, C Quereux, P Birembaut, C Clavel, Int. J. Cancer (2002) 102,519–525)

CONCLUSIONI L’associazione HPV DNA + PAP test è sensibilissima e il valore predittivo negativo della combinazione è del 100% L’impiego del HPV test in un programma di screening del cancro del collo dell’utero fornisce ai medici e alle donne una maggior garanzia che i risultati negativi siano precisi Le donne negative al HPV test possono essere rassicurate dicendo loro che corrono un rischio molto basso di sviluppare il cancro del collo dell’utero Lo screening concomitante con esame citologico e test del DNA dell'HPV potrebbe consentire di allungare in sicurezza gli intervalli di screening, riducendo in questo modo i costi.

VACCINI: E’ impossibile utilizzare virus inattivati come vaccino per l’uomo Percio’ si sfrutta la capacità immunogenica dei singoli antigeni capsidici(L1 e L2) Si creano vaccini PROFILATTICI completamente privi di rischio come vaccino ep. B

SINTESI La capacità immunogenica delle proteine capsidiche dell’HPV ( L1 e L2) è legata alla conformazione sterica delle stesse si utilizzano insetti, lieviti e batteri esprimenti antigeni ricombinanti Strutture proteiche morfologicamente simili ai virioni reali(virus like particles o VLPs)

L1 HA PIU’ ALTO POTERE IMMUNOGENICO CON PRODUZIONE DI ANTICORPI HPV SPECIFICI NELL’OSPITE LE L1VPLs SONO GENOTIPO SPECIFICHE E PROTEGGONO DAL TIPO VIRALE DA CUI DERIVANO MA NON DA ALTRI Vaccino approvato sia dalla Food and Drug Administration che dall’EMEA e già in commercio anche in Italia NOME COMMERCIALE: gardasil DISTRIBUTORE: sanofi-pasteur RANGE D’AZIONE: sierotipi 16,18,11,6

Attuale protocollo di applicazione 3 somministrazioni consecutive: 0, 2, 6 mesi i.m. A soggetti mai esposti al rischio (no rapporti sessuali) tra i 9 e 26 anni attualmente a pagamento con un costo di circa 180 euro a somministrazione protocollo Regione Toscana: in fascia A per le bambine di 11 anni +1 e 12 anni –1

Cosa ci si aspetta dal vaccino 100% riduzione condilomi 90% riduzione lesioni preinvasive cervicali Koutsky, 2005 Ridurre la frequenza dei controlli cito-colposcopici Ridurre le terapie conservative per lesioni preinvasive CONTENIMENTO DEI COSTI