ATTIVITA’ CELLULARE Segnale Attivazione di specifici pacchetti di geni Esecuzione di uno dei programmi di attività cellulare Proliferazione Differenziamento Arresto e Quiescenza Morte cellulare Nabissi 2014 M.NABISSI 1

Omeostasi cellulare e apoptosi L’omeostasi cellulare è frutto di un sottile equilibrio, finemente regolato, tra proliferazione e morte cellulare MOLTIPLICAZIONE NUMERO (MASSA) CELLULARE MORTE (MITOSI) (APOPTOSI) se in eccesso se in eccesso TUMORI DEGENERAZIONE/APLASIA se in difetto se in difetto Nabissi 2014 M.NABISSI 2

MORTE CELLULARE Nabissi 2014

MECCANISMI DI MORTE CELLULARE NECROSI Evento accidentale Passivamente subito dalle cellule Interessa gruppi di cellule Dovuto a trauma, veleno, anossia, ecc La lisi della cellula causa fenomeni di infiammazione e di autoimmunità APOPTOSI Evento programmato Attivamente realizzato dalle cellule Interessa cellule singole Realizzato di norma in condizioni fisiologiche La frammentazione della cellula e le modificazioni di superficie favoriscono la fagocitosi AUTOFAGIA - Permette alle cellule in condizione di malnutrimento o prive di fattori di crescita di sopravvivere. Se la mancanza di stimoli persiste le cellule si “autodigeriscono” e muoiono. Nabissi 2014 M.NABISSI 4

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LA NECROSI La necrosi, è l’ evidenza strutturale della morte di gruppi di cellule di un tessuto o di un organo. Nella zona di avvenuta necrosi le delimitazioni extracellulari scompaiono ed il tessuto si trasforma in una massa amorfa, con conseguente rilascio di sostante intracellulari negli spazi extracellulari. Questo fenomeno comporta, spesso, attivazione di un processo infiammatorio in quanto le sostanze rilasciate dalla cellula necrotica possono richiamare (chemiotassi) i leucociti o attivare una risposta antigenica. Nabissi 2014

Necrosi Le modificazioni ultrastrutturali della cellula, in cui si è attivato il processo di morte per necrosi, possono essere suddivise come segue: - Cariolisi (degradazione del DNA causata dall’attività delle DNasi) - Picnosi: (riduzione del nucleo) - Cariolessi: (frammentazione del nucleo picnotico, fino alla sua scomparsa) - Alterazioni della membrana plasmatica - Modificazioni dell’attività (deplezione di ATP) e della struttura dei mitocondri - Dilatazione del reticolo endoplasmatico (per aumento del Ca2+ intracellulare, perdita dell’osmolarità cellulare). Nabissi 2014 7

Mediatori del processo di necrosi Specie reattive dell’ossigeno, ioni calcio, PARP (poly–ADP–ribose polymerase) proteasi calcio-attivate non lisosomiali (Calpaine) e catepsine mediano il processo di necrosi. PARP è una DNA-repair enzyme che puo’ diminuire fortemente le riserve di ATP quando catalizza la riparazione del DNA, che avviene durante un danno. Calpaine si attivano quando la concentrazione di calcio è elevata. Le Catepsine vengono liberate nel citoplasma dopo che le calpaine attivate compromento l’integrità delle membrane lisosomiali. I lisosomi contengono piu’ di 80 tipi diversi di enzimi idrolitici, incluso le catepsine. Rilasciati nel citoplasma questi enzimi degradano le strutture cellulari, interferendo con il normale metabolismo, e la morte è inevitabile. Nabissi 2014

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PICNOSI-CARIOLESSI-CARIOLISI Nabissi 2014 CARATTERISTICHE NECROSI VOLUME CELLULARE AUMENTO NUCLEO PICNOSI-CARIOLESSI-CARIOLISI MEMBRANA CITOPLASMATICA DANNEGGIATA CONTENUTO CELLULARE DIGESTIONE ENZIMATICA INFIAMMAZIONE DELLE AREE ADIACENTI FREQUENTE RUOLO FISIOLOGICO O PATOLOGICO SEMPRE PATOLOGICO 10

calcificazione delle cellule, con riempimento della cellula morta con STEATONECROSI CON SAPONIFICAZIONE. Saponi di calcio nelle zone di distruzione lipidica Figure mieliniche calcificazione delle cellule, con riempimento della cellula morta con fosfolipidi degradati (dette figure mieliniche), che vengono poi degradate dai macrofagi, con formazione di saponi di calcio ed di un sito infiammatorio. Nabissi 2014

A) Miocardio normale, B) cellule del miocardio prive di nucleo La necrosi coagulativa implica la conservazione della struttura della cellula per alcuni giorni, come nel caso dell’infarto del miocardio dove il danno o l’aumento di acidosi cellulare denatura le proteine ma anche gli enzimi degradativi A) Miocardio normale, B) cellule del miocardio prive di nucleo Nabissi 2014 12

POLMONE TUBERCOLARE- NECROSI CASEOSA Un tipo particolare di necrosi coagulativa è la necrosi caseosa. Deve il suo nome all’aspetto macroscopico del tessuto (bianco e simile al formaggio). Si distingue dalla normale necrosi coagulativa perché in essa la normale architettura del tessuto appare completamente scomparsa. Nabissi 2014 13

Necrosi colliquativa: predomina la digestione enzimatica, il tessuto diventa molle e liquefatto principalmente come conseguenza dell’azione degli enzimi litici rilasciati dai leucociti, richiamati nel sito necrotico (chemiotassi). La necrosi colliquativa è caratteristica delle infezioni batteriche, dato che questi organismi stimolano l’accumulo di cellule infiammatorie. La completa digestione delle cellule morte, con conseguente trasformazione del tessuto in una massa fluida e viscosa, comprende spesso la formazione di pus. Nabissi 2014

l’accumulo di cellule infiammatorie. Necrosi colliquativa Caratteristica delle infezioni batteriche, dato che questi organismi stimolano l’accumulo di cellule infiammatorie. Completa digestione delle cellule morte, con conseguente trasformazione del tessuto in una massa fluida e viscosa. Spesso conprende la formazione di pus. Nabissi 2014 15

Un altro tipo particolare di necrosi è la gangrena che si verifica in un arto con interruzione completa dell’irrorazione sanguigna e conseguente necrosi coagulativa. Se si sovrappone un’infezione batterica con conseguente colliquazione si definisce gangrena umida. Necrosi grassa (steatonecrosi): indica la presenza di zone di distruzione lipidica causate dal rilascio di lipasi

APOPTOSI:“suicidio cellulare” È una modalità di morte cellulare “attiva”, tipica delle cellule di organismi pluricellulari e viene anche descritta come una forma di “suicidio altruista”, in quanto spesso la cellula “si sacrifica” per il bene dell’intero organismo. Le modalità della morte per apoptosi sono finalizzate a evitare l’instaurarsi di fenomeni di INFIAMMAZIONE e di AUTOIMMUNITÀ, ed il fatto che non dia luogo a fenomeni di infiammazione fa sì che la morte cellulare non sia avvertita dall’organismo (morte indolore) Nabissi 2014 M.NABISSI 17

PERCHÉ SI PARLA DI PROGRAMMA APOPTOTICO? Perché l’apoptosi è un processo cellulare innescato da induttori specifici, in quanto richiede la trascrizione di specifici geni. L’apoptosi fisiologica avviene naturalmente nell’organismo, per favorire l’eliminazione di cellule che hanno terminato la loro funzione, in cellule danneggiate o in condizioni d’adattamento cellulare Nabissi 2014 M.NABISSI 18

SVILUPPO EMBRIONALE/FETALE E METAMORFOSI NORMALE TURN-OVER TISSUTALE: epitelio intestinale, i neutrofili dopo il termine dell’infiammazione, linfociti al termine di una risposta immunitaria. ONTOGENESI E OMEOSTASI DEL SISTEMA IMMUNITARIO: L’eliminazione di linfociti auto-reattivi potenzialmente pericolosi, prima e dopo la loro formazione e maturazione. ATROFIA ORMONE-DIPENDENTE: L’involuzione ormone-dipendente nell’adulto, come la distruzione delle cellule dell’endometrio durante il ciclo mestruale, atresia dei follicoli ovarici nella menopausa, regressione della mammella dopo svezzamento, atrofia prostatica dopo castrazione. DEPRIVAZIONE DI FATTORI DI CRESCITA o INDUCENTI: L’eliminazione cellulare in popolazioni cellulari proliferanti. Nabissi 2014 M.NABISSI 19

APOPTOSI TOSSINE, FARMACI RADIAZIONI INFEZIONI VIRALI CITOTOSSICITÀ CELLULO-MEDIATA: la morte cellulare indotta dai linfociti citotossici, un meccanismi di difesa contro linfociti infettati da virus o contro cellule tumorali. Per apoptosi patologica s’intende la morte cellulare indotta da una serie di stimoli dannosi, ad esempio il danno cellulare in particolari malattie virali, come l’epatite virale in cui l’eliminazione delle cellule è largamente dipendente dall’apoptosi, l’atrofia patologica negli organi parenchimali dopo ostruzione dei dotti (pancreas, reni) e la morte cellulare nelle neoplasie. Nabissi 2014 M.NABISSI 20

Quindi l’apoptosi si puo’definire un programma intracellulare strettamente regolato, in cui le cellule destinate a morire attivano enzimi che degradano il DNA, le proteine nucleari e citoplasmatiche. La membrana citoplasmatica rimane intatta ma la struttura della cellula si altera a tal punto da essere bersaglio di cellule fagocitarie . Nabissi 2014 M.NABISSI

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PICNOSI-CARIOLESSI-CARIOLISI FRAMMENTAZIONE CARATTERISTICHE NECROSI APOPTOSI VOLUME CELLULARE AUMENTO RIDOTTO NUCLEO PICNOSI-CARIOLESSI-CARIOLISI FRAMMENTAZIONE MEMBRANA CITOPLASMATICA DANNEGGIATA INTATTA CONTENUTO CELLULARE DIGESTIONE ENZIMATICA INTATTO, PUO’ ESSERE SECRETO IN CORPI APOPTOTICI INFIAMMAZIONE DELLE AREE ADIACENTI FREQUENTE NO RUOLO FISIOLOGICO O PATOLOGICO SEMPRE PATOLOGICO SPESSO FISIOLOGICO, MEZZO PER ELIMINARE LE CELLULE Nabissi 2014 M.NABISSI 23

CARATTERISTICHE BIOCHIMICHE DELL’APOPTOSI Le cellule apoptotiche mostrano delle caratteristiche biochimiche che sono alla base delle modificazioni struttutali descritte. CLIVAGGIO DELLE PROTEINE La degradazione delle proteine coinvolge le CASPASI, proteasi cisteina-dipendenti, che sono presenti, come proenzimi, nella cellula in condizione fisiologica e devono essere attivati per indurre apoptosi. Le caspasi oltre che distruggere altre proteine attivano Dnasi che degradano il DNA. AUMENTO DELLA CONCENTRAZIONE DI Ca2+ INTRACELLLULARE Le modificazioni biochimiche della membrana plasmatica inducono variazioni osmotiche ed della concentrazione elettrolitica nella cellula apoptotica. Tali variazioni inducono entrata di Ca2+ dall’ambiente extracellulare e rilascio di Ca2+ dai depositi intracellulari (reticolo endoplasmatico liscio, mitocondri). L’aumento di Ca2+ è alla base dell’attivazione di diversi enzimi con attività degradativi verso proteine e DNA. Nabissi 2014 M.NABISSI 24

RICOGNIZIONE FAGOCITARIA ROTTURA DEL DNA Il DNA viene tagliato in multipli di 180-200 bp da endonucleasi Mg2+ e Ca2+ dipendenti RICOGNIZIONE FAGOCITARIA Le cellule apoptotiche esprimono fosfatidilserina sulla parte esterna della membrana (evidenziabile colorando le cellule con annexina V). Queste modificazioni a livello di membrana possono essere riconosciute dai macrofagi che fagocitano così le cellule apoptotiche. A- DNA cellule integre B- DNA di cellule in apoptosi C- DNA di cellule in necrosi Nabissi 2014

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MECCANISMI di attivazione dell’APOPTOSI L’APOPTOSI E’ INDOTTA DA STIMOLI ESTERNI E/O INTERNI, IN GRADO DI ATTIVARE DUE VIE (PATHWAYS) IN PARTE DISTINTE CHE VENGONO IDENTIFICATI COME:  PATHWAY INTRINSECO, controllato dalla permeabilizzazione della membrana mitocondriale PATHWAY ESTRINSECO, nel quale recettori di morte stimolano la cascata di eventi apoptotici. I mediatori di entrambi i pathways sono LE CASPASI, infatti il processo apoptotico consiste in una fase iniziatrice (durante la quale vengono attivate le caspasi iniziatrici) e in una fase effettrice in cui il secondo gruppo di caspasi (effettrici) agiscono per indurre la morte cellulare. Nabissi 2014 M.NABISSI

CASPASI C = cisteina nel centro reattivo; ASP = riconoscono un residuo di acido aspartico nell’ambito di una sequenza di 4 aminoacidi; ASI = sono enzimi proteolitici Le caspasi sono presenti nel citoplasma in forma di zimogeni e vengono attivate successivamente all’attivazione dei pathways apoptotici. Le caspasi “iniziatrici” (2, 8, 9, 10) sono attivate dagli “adattatori”; a loro volta attivano le caspasi “effettrici” (3, 6, 7). (La caspasi 1, 4, 5 sono coinvolte nella maturazione di citochine). L’attivazione consiste nel taglio proteolitico, con formazione di due frammenti; i 2 frammenti brevi e i 2 frammenti lunghi di due caspasi uguali formano un tetramero (forma attiva) . Nabissi 2014 M.NABISSI 28

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Substrati sensibili CAD (deossiribonucleasi caspasi-sensibile): presente nel citosol in forma inattiva e mediante distacco dell’inibitore causato dalla caspasi 3, la CAD migra nel nucleo degradando i nucleosomi, frammentando il DNA in frammenti di circa 180 bp. Proteine del citoscheletro (fodrina, gelsomina) PARP-1 (poli-ADP-ribosio polimerasi) che inattivata dalla caspasi 3 , non puo’ piu’ svolgere la funzione di enzima responsabile della riparazione del DNA e d’inibitore delle endonucleasi. Nabissi 2014 M.NABISSI

Effetti a livello del nucleo Nabissi 2014 M.NABISSI 31

Compartimentalizzazione cellulare delle caspasi La maggior parte delle procaspasi sono localizzate a livello del citoplasma, ma una piccola frazione di questi zimogeni sono compartimentalizzati in organelli cellulari. Ad esempio la procaspasi 3 è presente nello spazio Intermembranale del mitocondrio, complessata con le Heat Shock Protein (Hsp60 o Hsp 10). Dopo attivazione del processo di apoptosi, la procaspasi 3 viene rilasciata dal complesso e migra nel citoplasma. Inoltre l’attivazione dei segnali di morte inducono anche la migrazione delle caspasi (2, 9, 3) nel nucleo. Nabissi 2014 M.NABISSI

Via Apoptotica Estrinseca La via estrinseca o pathway dei recettori di morte è attivata dalla famiglia dei recettori del TNF (tumor necrosis factor), la quale è composta da recettori che inoltre hanno un ruolo fondamentale nel mantenere l’omeostasi cellulare e nel riconoscimento immunitario. L’attivazione di questa via si ha quando un ligando Di morte si lega al dominio extracellulare del suo recettore con conseguente attivazione delle caspasi iniziatrici. La famiglia di tali recettori è composta da diversi membri, i quali sono differentemente espressi nelle varie popolazioni cellulari. Questi recettori sono: - TNFR1 ( recettore del TNF) -CD95 (denominato anche Apo1 o Fas) -TRAIL-R1, -TRAIL-R2, NGFR Nabissi 2014 M.NABISSI 33

Death receptors and their ligands. Cystein-rich extracellular domains. 80 amino acid ‘death domain’ motif in their cytoplasmic C-terminal region, which is crucial for transmitting apoptotic or other signals. Nabissi 2014

Via Estrinseca Questi recettori contengono un dominio citoplasmatico implicato nelle interazioni proteina-proteina detto DOMINIO DI MORTE (DD), indispensabile per liberare segnali apoptotici. I recettori meglio studiati sono quelli TNFR1 e del recettore Fas (CD95). Nabissi 2014 M.NABISSI

ATTIVAZIONE Quando il ligando (TNF; tumor necrosis factor o FasL; ligando del recettore Fas) si è associato alla porzione extracellulare del recettore, il recettore trimerizza e la porzione intracellulare, caratterizzata da un dominio DD (Death Domain), dirige la formazione di un complesso proteico denominato DISC (death-inducing signaling complex) mediante il reclutamento di una specifica proteina adattatrici FADD (Fas- associated death domain, per il Fas) o TRADD (TNFR-associated death domain) per il TNFR. Questa proteina trasporta un dominio DED (death effector domain) che permette di reclutare le pro-caspasi 8 e l’attivano (induzione per prossimità). La caspasi-8 attivata agisce attivando la pro-caspasi 3 che agisce sui substrati sensibili. Nabissi 2014 M.NABISSI 36

In alcuni tipi cellulari le caspasi 8 non sono particolarmente efficaci nel clivaggio della caspasi 3 e quindi agiscono sulla proteina BID che troncata dalla caspasi 8, in forma corta (t-BID) trasloca nella membrana mitocondriale dove si lega ed attiva BAX e Bad. Questa attivazione permette la traslocazione di BAX nello strato esterno della membrana mitocondriale , causando l’oligomerizzazione di BAX e BAD con conseguente rilascio di citocromo c ed inibizione delle IAP (inhibitor of apoptosis pathways) stabilendo un legame fra via estrinseca e via intrinseca. Nabissi 2014 M.NABISSI 37

APOPTOSI MEDIATA DA TNF La citochina TNF è un mediatore dell’infiammazione ma è anche capace di indurre apoptosi. Il legame di TNF al suo recettore porta ad un legame intracellulare tra la porzione citoplasmatica del TNFR-1 con il dominio di morte TRADD attivando l’apoptosi mediante la cascata delle caspasi. Nabissi 2014 M.NABISSI 38

VIA ESTRINSECA attivazione dell’apoptosi Segnalazione via NF-kB e pathway di proliferazione Nabissi 2014 M.NABISSI 39

QUALE MECCANISMO INDUCE LA PERMEABILIZZAZIONE? La via mitocondriale L’attivazione della via mitocondriale si attiva mediante una permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna con conseguente dissipazione del gradiente di protoni che è responsabile del potenziale transmembrana mitocondriale. La permeabilizzazione coinvolge anche la membrana mitocondriale esterna con conseguente perdita di proteine solubili, normalmente confinate negli spazio intermembranali dei mitocondri. QUALE MECCANISMO INDUCE LA PERMEABILIZZAZIONE? Nabissi 2014 M.NABISSI

La formazione di pori di transizione di membrana a livello 1 La formazione di pori di transizione di membrana a livello mitocondriale coinvolge proteine pro-apoptotiche della famiglia Bcl-2, come Bax, dopo oligomerizzazione o stimolazione mediata dalla proteina tBid e meccanismo antagonizzato dalla proteina Bcl-2. 2 La permeabilizzazione della membrana interna avviene come conseguenza della formazione di pori non specifici (indotti da stimoli apoptotici). La successiva perdita del potenziale di membrana induce il rigonfiamento della membrana mitocondriale con conseguente rottura della membrana esterna Nabissi 2014 M.NABISSI

Questo modello coinvolge i canali anionici voltaggio-dipendenti 3 Questo modello coinvolge i canali anionici voltaggio-dipendenti (VCAD), che sono le proteine maggiormente presenti nella membrana mitocondriale esterna. In condizione normale questi canali sono permeabili a proteine con un peso molecolare fino a 5kD. L’interazione con la proteina Bax permette un aumento di permeabilità di questi canali con il possibile passaggio del citocromo c nel citoplasma. 4 Questo modello indica che la formazione dei pori di transizione di membrana nasce dalla fusione dei VCAD con i pori aspecifici (modello 2), sotto il controllo delle proteine della famiglia Bcl-2. QUALUNQUE SIA IL MODELLO, LA PERMEABILIZZAZIONE DELLE MEMBRANE MITOCONDRIALI INDUCONO LA FUORIUSCITA DEL CITOCROMO C NEL CITOPLASMA. Nabissi 2014 M.NABISSI

VIA INTRINSECA La via intrinseca è attivata da stress cellulari (deprivazione di fattori di crescita, ipossia, danno al DNA) o agenti antitumorali. Nelle cellule normali, il danno al DNA puo’ indurre due possibili reazioni; la riparazione e/o la tolleranza del danno, oppure la stimolazione della cascata di segnali che inducono la morte della cellula danneggiata. Nella trasformazione neoplastica queste reazioni sono normalmente alterate. Le principali lesioni letali al DNA sono le rotture del doppio filamento (double strand breaks; DSB), le quali sono riconosciute da proteine (chinasi) con capacità di riparazione. Una di queste proteine è ATM (ataxia telangiectasia mutated) attivata dopo lesione del DNA indotta da radiazioni ionizzanti. ATM induce la fosforilazione di diversi substrati coinvolti con il blocco del ciclo cellulare e nell’induzione dell’apoptosi (p53, CHK1, CHK2, p21). In base al danno o alla capacità di riparazione p53 puo’ indurre la trascrizione di geni pro-apoptotici (Bax, PUMA) Nabissi 2014 M.NABISSI 43

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Lo stimolo che induce la via intrinseca induce la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna e rilascio del citocromo c che si lega al fattore Apaf-1 (apoptotic protese-activating factor-1) inducendo oligomerizzazione e cambiandone la sua conformazione. Questo cambiamento comporta l’esposizione del DOMINIO DI RECLUTAMENTO DELLE CASPASI (ARD), in presenza di ATP. Apaf-1, è cosi’in grado di reclutare ed attivare la pro-caspasi 9 formando un complesso chiamato APOPTOSOMA, il quale attiva la pro-caspasi 9, che a sua volta attiva le caspasi effettrici (3, 6, 7) con conseguente inizio dei fenomeni apoptotici (frammentazione del DNA, disgregazione del citoscheletro, ecc..). Nabissi 2014 M.NABISSI

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MODULATORI DELL’APOPTOSI Localizzandosi sulla membrana esterna del mitocondrio, favoriscono (se pro-apoptotici) o rendono meno facile (se anti-apoptotici) la formazione di megacanali e la conseguente fuoriuscita di molecole pro-apoptotiche Sono strutturalmente simili tra loro (domini BH1-4 + dominio transmembrana) Anti-apoptotici: Bcl-2, BclXL, Pro-apototici: Bad, Bax, Bak, Bid Stimoli endogeni ed esogeni agiscono sulla propensione all’apoptosi della cellula alterando la loro quantità, localizzazione e stato di attività Nabissi 2014 M.NABISSI 47

La famiglia Bcl-2 Il gene Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2) fu identificato nelle cellule B del linfoma follicolare e la sua over-espressione antagonizza l’induzione dell’apoptosi mediata da diversi stimoli, compresi quelli da chemioterapici. La sua over-espressione in diversi tipi di tumore contribuisce alla crescita cellulare ed in combinazione con l’over-espressione di altri oncogeni (c-myc), alla trasformazione neoplastica. Diversi membri della famiglia Bcl-2 sono stati identificati e caratterizzati per la loro funzione pro-apoptotica e quindi potenziali oncosoppressori (Bax, Bak, Bim, Bid….), o funzione anti-apoptotica e quindi potenziali oncogeni (Bcl-2, Bcl-XL, ..). Inoltre il genoma di alcuni virus patogeni (Epstein-Barr, sarcoma di Kaposi virus) codificano per proteine simili a Bcl-2. Nabissi 2014 M.NABISSI 48

Le proteine anti-apoptotiche Bcl-2 contengono quattro domini conservati BH (1-4), omologhi a Bcl-2, mentre i membri pro-apoptotici possono essere suddivisi in quelli con tre domini omologhi (Bax, Bak) o con solo il dominio BH3 conservato (Bid, Bim, Bad). Inoltre molti di questi membri contengono regioni carbossi-terminali che hanno affinità per le membrane, in particolare quella esterna dei mitocondri. In assenza di segnali di morte, molti membri pro-apoptotici sono localizzati nel citosol o nel citoscheletro e solo dopo segnali di morte assumono una modificazione conformazionale che li rende capaci di migrare verso le membrane mitocondriali. Le interazioni fra membri pro ed anti-apoptotici modula la redistribuzione del citocromo c nel mitocondrio. Nabissi 2014 M.NABISSI

Le proteine pro.apoptotiche possono essere suddivise in effettori (causano depolarizzazione ) o solo BH3 (sensibilizzatori, trasmettono il segnale apoptotico agli effettori). Modello indiretto: BAX e BAD sono legati ed inibiti da Bcl-2 quando sono nello stato costitutivamente attivo e il legame di BH3 a Bcl-2 è sufficiente per liberare Bad/BAX. Modello diretto: Bad/Bax sono attivati da BH3 e Bcl-2 previene la depolarizzazione della membrana mitocondriale sequestrando BH3 o inibendo Bad/Bax attivati. Nabissi 2014

Bcl-2 modulano la morte cellulare La famiglia Bcl-2 modula la morte cellulare in parte influenzando il rilascio di citocromo c e diverse altre proteine, ma stabilizzano anche il potenziale transmembrana dei mitocondri regolandone il flusso protonico, inibendo la formazione di ROS e prevenendo l’acidificazione citoplasmatica. Nel processo apoptotico Bax dimerizza e si inserisce nella membrana mitocondriale, alterandone la funzione. I vari membri della famiglia Bcl2, avendo dei domini proteici comuni possono formare omo o eterodimeri. La formazione di questo complessi permette di regolare la risposta pro od antiapoptotica. Bcl2-Bcl2: anti-apoptotica__Bax-Bcl2: inattivo__Bax-Bax: apoptotico L’attività di Bcl-2 puo’ essere regolata da fosforilazione, con perdita della sua funzione anti-apoptotica, da alcuni farmaci antitumorali che interagiscono con i monomeri di tubulina ed influenzano la polimerizzazione dei microtubuli. Nabissi 2014 M.NABISSI 51

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VIA INTRINSECA Le altre proteine pro-apoptotiche, (come BID), cooperano con BAX e BAD nell’indurre il rilascio di citocromo c. Inoltre il dimeri Bax-Bid induce il rilascio di AIF (Apoptosis Inducing Factor) e Smac/DIABLO che blocca i fattori IAP (proteine inibitrici l’apoptosi). AIF collabora nell’indurre il rilascio di citocromo c, ma ha anche la capacità di traslocare nel nucleo ed indurre la condensazione della cromatina e l’apoptosi mediante una via caspasi indipendente (attivazione di endonucleasi). Inoltre Bcl-XL è in grado di legarsi al fattore Apaf-1 inattivandolo. Nabissi 2014 M.NABISSI 53

Inibitori dell’apoptosi (IAP family) Le proteine IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) sono proteine altamente conservate e sono caratterizzate da almeno un dominio BIR (baculovirus inhibitor of apoptosis repeat). Questo dominio è presente in diverse proteine fra cui cIAP1, cIAP2, XIAP e Survivina. La maggior parte delle proteine IAP son altamente espresse nei tessuti embrionali e quasi assenti nelle cellule differenziate, mentre la loro espressione aumenta nelle cellule tumorali. Le IAP si legano e rendono inattive le caspasi, ma possono svolgere un ruolo inibitorio del processo apoptotico anche legandosi alle proteine pro-apoptotiche Smac/DIABLO (proteine che promuovono l’attivazione delle caspasi, riducendo l’inibizione delle caspasi IAP-mediata). Nabissi 2014 M.NABISSI

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INIBITORI DELL’APOPTOSI (cFLIP) Un’altra proteina che regola negativamente l’apoptosi interferendo con l’attivazione delle caspasi è la proteina FLICE (cFLIP o usurpina), che contiene un dominio DED mancante del sito catalitico attivo e dei residui aminoacidici che formano il pacchetto di proteine necessarie (DISC) per attivare la pro-caspasi 8. Quindi cFLIP previene il legame delle pro-caspasi 8 al complesso formatosi dall’attivazione dei death receptors. Nabissi 2014 M.NABISSI 56

EFFETTORI DELL’APOPTOSI AIF. Liberato dai mitocondri quando si forma il megacanale, causa il rilascio di citocromo c, ma puo’ traslocare nel nucleo dove attiva condensazione della cromatina ed avvia un processo apoptotico caspasi-indipendente attraverso l’aumento dei livelli di nucleasi PARP-1. PARP-1 è responsabile della riparazione del DNA ed è coinvolta nella trascrizione genica. La sua eccessiva attività scatena il rilascio di AIF dai mitocondri. Nabissi 2014 M.NABISSI 57

Il citocromo c si lega ad APAF-1 monomero e ne induce la eptamerizzazione, formando l’apoptosoma. Livelli fisiologici di ATP o tRNA bloccano il legame del citocromo c ad APAF-1 Citocromo c richiede una molecola di Fe, fornita dalla spazio intermembranale, per potersi legare ad APAF-1. La fosforilazione della caspasi-9 da parte delle chinasi cicline dipendenti (CDK)-B [ciclo cellulare] e ERK 1/2 [proliferazione], inibiscono la caspasi 9, mediante un meccanismo ancora sconosciuto. Nabissi 2014

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Regolazione trascrizionale dei Bcl-2 Un ultimo meccanismo che regola l’espressione e la funzione di Bcl-2 è la sua regolazione trascrizionale. p53 si lega al promotore del gene Bax mentre down- regola l’espressione di Bcl-2. Nabissi 2014 M.NABISSI 60

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Il granzyme B, una caspasi già attiva, viene inserita da linfociti citotossici nella cellula bersaglio, inducendone l’apoptosi Nabissi 2014 M.NABISSI 62

Per quanto riguarda il ruolo del fattore trascrizionale NF-kB NF-kB ed Apoptosi Per quanto riguarda il ruolo del fattore trascrizionale NF-kB nell’ambito del processo apoptotico, è ben descritto come NF-kB inibisca l’apoptosi mediante attivazione di fattori anti-apoptotici della famiglia Bcl-2 (in particolare il gene Bcl-xL) o del gene FLIP (fattore inibitore dell’apoptosi). Comunque in altre situazioni fisiologiche NF-kB induce la morte cellulare mediante aumento dell’espressione di p53 o attivando l’espressione dei geni per Fas o FasL. In sintesi il ruolo di NF-kB nel processo apoptotico sembra sia regolato dalla condizione fisiologica e dal tipo di popolazione cellulare. Nabissi 2014 M.NABISSI

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- p53, p27, Bad, Bax, Nabissi 2014

Up-regolazione di Fas mediante chemioterapici Terapia oncologica Up-regolazione di Fas mediante chemioterapici Molti tipi di cellule tumorali hanno sviluppato meccanismi multipli per resistere alla morte cellulare Fas-indotta, come la: - - perdita dell’espressione di Fas, - mutazione dei domini funzionali del recettore Fas, - secrezione di Fas solubile, - over-espressione dei prodotti antiapoptotici della famiglia Bcl-2 - over-espressione di cFlip, La terapia con farmaci che inducono l’espressione del gene Fas (cycloeximide, actinomicina D, interferone g ) permette in parte di sensibilizzare le cellule all’apoptosi FasL-indotta. L’uso di FasL rimane comunque dannoso, in quanto induce apoptosi degli epatociti, i quali esprimono alti livelli di Fas. Nabissi 2014 M.NABISSI

Terapia oncologica TRAIL TRAIL: TNF-related apoptosis inducing ligand, è una proteina omologa a TNF e FasL, che si trova come proteina transmembrana o in forma solubile. I recettori per il TRAIL, includono due tipi di recettori (R1 e R2) con DD simili a quelli del Fas eTNF-R e un altro gruppo che non ha domini di morte citoplasmatici e quindi non inducono morte una volta attivati (decoy receptor, R3 e R4). La somministrazione di TRAIL associata a chemioterapici induce in alcuni tipi di cellule tumorali apoptosi, mediata dall’attivazione dei R1 e R2 che inducono anche aumento dell’espressione delle molecole pro-apoptotiche, FADD e procaspasi e diminuiscono i livelli di c-FLIP. Nabissi 2014 M.NABISSI

Death-Receptor Dependent Pathway Il sistema Fas-FasL ha un ruolo importante nel normale sviluppo dei linfociti T e nell’autodistruzione del linfociti T attivati, inoltre l’interazione Fas-FasL è anche uno dei meccanismi con il quale le cellule citotossiche del sistema immunitario possono uccidere le cellule bersaglio esprimenti il recettore Fas. Mutazioni del gene Fas sono caratteristiche di alcuni tumori o patologie congenite (sindrome linfoproliferativa autoimmune). Nell’ambito delle patologie tumorali, nelle quali il processo apoptotico è inibito, l’uso di chemioterapici che inducono trimerizzazione del recettore Fas (quindi attivazione anche in assenza del ligando Fas-L) possono indurre apoptosi delle cellule tumorali. Nabissi 2014 M.NABISSI

Agenti pro-apoptotici come bersaglio il pathway estrinseco Nabissi 2014