EFFETTI DELLA PROTEINA RICOMBINANTE MnSOD FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI   Corso di Laurea Magistrale in Neurobiologia EFFETTI DELLA PROTEINA RICOMBINANTE MnSOD IN MODELLI IN VIVO E IN VITRO DI INVECCHIAMENTO E NEURODEGENERAZIONE Candidata Maria Lo Giudice matricola: 1466710      Relatore Giancarlo Poiana Correlatore Annamaria Confaloni Anno Accademico 2013-2014

SOD= SUPEROSSIDODISMUTASI: tra i più importanti enzimi antiossidanti, presenti in tutte le cellule che metabolizzano l’O2. 3 isoforme Cu, Zn-SOD SOD citosolica- nucleo, spazio mitocondriale intermembrana lisosomi, perossisomi. Cu, Zn-SOD SOD extracellulare Mn-SOD SOD mitocondriale- matrice mitocondriale.

Promettenti potenzialità rMnSOD: LSA-type MnSOD identificata in vescicole secrete da cellule LSA e ottenuta in forma ricombinante (Mancini et al., 2006). Azione enzimatica comune a tutte le SOD e particolari proprietà strutturali e funzionali: Localizzazione: mitocondrio, RER, vescicole secretorie. Struttura: Contiene la sequenza leader all’N-terminale, ritenuta responsabile dell’internalizzazione della proteina nelle cellule (Borrelli et al., 2011). Applicazioni: Funzione antiossidante Azione anti-tumorale (Pica et al., 2010) Effetto radio-protettivo (Borrelli et al., 2009) Azione protettiva nella cirrosi epatica (Guillaume et al., 2013) Promettenti potenzialità Sistema nervoso….

INVECCHIAMENTO CEREBRALE In quali condizioni del SN? In quali condizioni del SN? L’overespressione di SOD2 contrasta lo stress ossidativo, la morte neuronale e l’infiammazione indotti da diversi stimoli neurodegenerativi (Holley et al., 2011). Mn-SOD Coinvolgimento della SOD2 in patologie neurodegenerative (AD, PD, SLA) e nel “normale” declino cognitivo età-correlato (Flynn et al., 2013). INVECCHIAMENTO CEREBRALE Graduale e fisiologica modificazione strutturale e funzionale, del cervello, spesso associata a gradi variabili di declino cognitivo. NEURODEGENERAZIONE Fenomeno patologico consistente nella progressiva perdita di funzione o morte di neuroni e/o cellule accessorie, con conseguente compromissione dell’intero sistema nervoso. Stress ossidativo Neuroinfiammazione Morte cellulare

Mn-SOD NEUROINFIAMMAZIONE STRESS OSSIDATIVO: ECCESSO DI ROS MnSOD possiede un ruolo protettivo dall’induzione dell’apoptosi innescata dal TNF-α. (Delhalle et al., 2002) MnSOD opera la neutralizzazione dell’O2·-. (Fukui et al., 2010) MORTE CELLULARE MnSOD previene il rilascio dal mitocondrio di fattori pro-apoptotici come il citocromo c. (Holley et al., 2011)

TESTARE L’EFFETTO DELLA rMnSOD Stress ossidativo Neuroinfiammazione Morte cellulare Scopo della ricerca TESTARE L’EFFETTO DELLA rMnSOD Modello in vivo di invecchiamento Modello in vitro di neurodegenerazione Analisi comportamentale Analisi biochimica Analisi cellulare

Materali e metodi Modello IN VIVO 9 topi, Trattati, sottoposti a trattamento intranasale con la rMnSOD 4,5 µM. 18 topi C57/BL maschi, di 18 mesi, divisi in 2 gruppi per il trattamento cronico di 10 giorni con la proteina ricombinante o la soluzione salina. 9 topi, Ctrl, sottoposti a trattamento intranasale con la soluzione salina. Al termine del trattamento….

Analisi comportamentale: Fear conditioning Materali e metodi Training: tone + shock Baseline Pause 3 min 90’’ 30’’ 2’’ 2’’ 30’’ 90’’ 30’’ 5 min 4 min 30’’ 30’’ 30’’ 30’’ 30’’

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY Analisi biochimica: valutazione dell’espressione delle citochine infiammatorie nelle cortecce (Cx) cerebrali. Materali e metodi Membrana su cui sono adesi gli anticorpi per 40 citochine: BLC, CD30L, Eotaxin, Eotaxin-2, Fas Ligand, Fractalkine, GCSF, GM-CSF, IFNγ, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-17, I-TAC, KC/CXCL1, Leptin/OB, LIX, Lymphotactin, MCP-1, MCSF, MIG, MIP-1α, MIP-1γ, RANTES, SDF-1, TCA-3, TECK, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α, sTNF-RI, sTNF-RII. Mediante una reazione antigene/anticorpo, il saggio rivela i livelli di citochine in ogni campione. MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY Cx trattato Cx Ctrl

Risultati modello in vivo

FEAR CONDITIONING: 4 Parametri: Freezing Grooming Not moving Crossing/min Gli animali Trattati e Ctrl presentano entrambi una diminuzione dell’attività locomotoria sia nel tone che nel context retest => nessuna differenza tra i 2 gruppi sperimentali.

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY Risultati Diminuzione per: IL-1β: -33% (p<0,01). IL-2: -20% (p<0,05). TNFα: -29% (p<0,05). sTNF-R2: -14% (p<0,05).

MOUSE INFLAMMATION ANTIBODY ARRAY Risultati Tendenza a diminuire per: l’IL-1α: -15% (p= 0,09). l’IL-3: -30% (p= 0,07). I-TAC: -25% (p= 0,09). LIX: -13% (p= 0,07). Tendenza ad aumentare per: MIP-1γ: +20% (p= 0,06).

Modello in vitro Cellule di neuroblastoma SK-N-BE Il trattamento con la rMnSOD 0,75 μM induce la quasi totale perdita della morfologia cellulare. - rMnSOD + rMnSOD 0,75 μM 3h + rMnSOD 0,75 μM 6h Conferma dell’azione anti-tumorale della rMnSOD, già descritta in letteratura (Mancini et al., 2008), estesa per la prima volta ad un tumore di origine nervosa.

Materali e metodi Modello in vitro Le cellule SK-N-BE, dopo trattamento di 10 giorni con acido retinoico 10 μM, sviluppano i prolungamenti cellulari e i marcatori di membrana caratteristici delle cellule nervose, mostrando un fenotipo neuron-like. Sottoposte a 2 stimoli tossici per simulare uno stato neurodegenerativo Menadione induttore del radicale O2·- nei mitocondri, causa stress ossidativo e disfunzione mitocondriale. Glutammato induttore di eccitotossicità.

MTT IMMUNOCITOCHIMICA % vitalità cellulare rispetto al Ctrl ** MTT Risultati Trattamento 20h SK-N-BE differenziate con la rMnSOD. Conferma dell’avvenuto differenziamento e della non tossicità della rMnSOD sulle cellule SK-N-BE differenziate. IMMUNOCITOCHIMICA Internalizzazione della rMnSOD nelle SK-N-BE dopo 3h di trattamento:

Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a: Materali e metodi Le SK-N-BE differenziate vengono sottoposte a: Trattamento con menadione Trattamento con glutammato 20h +rMnSOD 0,75 μM +glutammato 0,5 o 1 mM +rMnSOD 0,75 μM 1h +menadione 25 o 50 μM Valutazione dei ROS in fluorescenza mediante la sonda specifica 2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCDHF-DA Valutazione della vitalità cellulare mediante il saggio dell’MTT

Risultati modello in vitro

Trattamento con menadione: DCDHF-DA Risultati Men 50 μM Ctrl Men 25 μM - rMnSOD + rMnSOD 0,75 μM La rMnSOD risulta efficace nel contrastare l’incremento dei ROS.

% vitalità cellulare rispetto al Ctrl Trattamento con menadione: MTT Risultati ** * % vitalità cellulare rispetto al Ctrl Men 50 μM: -30% (p< 0,01) rispetto al Ctrl. Men 50 μM + rMnSOD: -20% (p< 0,05) rispetto al Ctrl.

Trattamento con glutammato: DCDHF-DA Risultati - rMnSOD Ctrl Glutam 0,5 mM Glutam 1 mM La rMnSOD risulta efficace nel contrastare l’incremento dei ROS indotto dal glutammato. + rMnSOD 0,75 μM

% vitalità cellulare rispetto al Ctrl Trattamento con glutammato: MTT Risultati * ** % vitalità cellulare rispetto al Ctrl Glut 1 mM: -16% (p< 0,05) rispetto al Ctrl. Glut 1 mM+ rMnSOD: -15% (p< 0,01) rispetto al Ctrl. Glut 0,5 mM+ rMnSOD: -18% (p< 0,01) rispetto al Ctrl.

Riassumendo: rMnSOD & modello in vivo Nessun effetto sul profilo cognitivo degli animali trattati. Riduzione significativa di IL-1β, IL-2, TNF-α e sTNF-RII. Riduzione vicina alla significatività di IL-1α, IL-3, I-TAC e LIX. Aumento significativo di MIP-1γ. Probabilmente attribuibile ai buoni livelli di prestazione nel test dimostrata dai topi controllo. La rMnSOD è in grado di agire sulla neuroinfiammazione, modulando l’espressione di importanti fattori che la promuovono. (Dilger et al., 2008)

Riassumendo: rMnSOD & modello in vitro Inefficacia nel contrastare la mortalità cellulare indotta dai 2 stimoli e lieve tossicità nel co-trattamento con il glutammato. Efficacia anti-tumorale su cellule di neuroblastoma SK-N-BE. Marcata azione di scavenger dei ROS, in seguito al trattamento con il menadione e con il glutammato. Probabilmente riconducibile all’eccessiva produzione di H2O2 non viene adeguatamente eliminata, a causa dei bassi livelli di catalasi che caratterizzano il cervello.

PROSPETTIVE FUTURE: Valutare l’effetto della rMnSOD su topi più anziani con evidenti deficit cognitivi e su modelli di malattie neurodegenerative con una forte componente neuroinfiammatoria. Valutare l’effetto della rMnSOD in vitro in co-trattamento con le catalasi.

Grazie per l’attenzione !!!!!! Dipartimento di Biologia Cellulare&Neuroscienze Laboratorio di Clinica, Diagnosi e Terapia delle Malattie del Sistema Nervoso Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Charles Darwin" Prof. Giancarlo Poiana Neuroteam: Annamaria Confaloni Alessio Crestini Paola Piscopo Lorenzo Malvezzi-Campeggi Roberto Rivabene Maria Lo Giudice Giulio Di Ciaccia Vania Batalha