Terapia cellulare e genica germinale/somatica

UNDIFFERENTIATED ES CELLS ES colonies (phase contrast) Feeder fibroblasts ES colonies

DIFFERENTIATED ES CELLS Partially differentiated ES colony Embryoid bodies Various cell types obtained from ES differentiation

DIFFERENTIATION OF ES CELLS

TERAPIA CON CELLULE ES DIFFERENZIATE IN VITRO

Come si studiano i geni, la loro FUNZIONE, importanza, relazione etc..? Come si capiscono i meccanismi biologici alla base della salute e della malattia (I.e regenerazione, invecchiamento?) Come si studiano I tessuti? Come e dove si scoprono e sperimentano nuovi farmaci

IL TOPO COME ORGANISMO MODELLO FONDAMENTALE PER LA MODERMA BIOMEDICINA Animali transgenici

LOSS OF FUNCTION! Ovvero USO DELLE CELLULE ES COME REAGENTI PER GENERARE I TOPI KNOCK-OUT, TOPI KNOCK-IN e TOPI CONTENEDI ALLELI “Floxed” (anche detti KNOCKOUT-CONDIZIONALI)

MANIPOLAZIONE DI CELLULE ES PER INTRODURRE MUTAZIONI MIRATE NEL GENOMA, MUTANTI A' LA CARTE…. UNA RIVOLUZIONE IN BIOLOGIA MOLECOLARE E MEDICINA SPERIMENTALE Mario Capecchi U. Utah, Nobel Medicina 2007

PRODUZIONE DI TOPI MUTANTI DA CELLULE ES

GENE TARGETING Caratteristiche ed applicazioni • Mutagenesi mirata: introduzione di modificazioni sito-specifiche nel genoma mediante ricombinazione omologa • I topi "knockout" costituiscono un tool estremamente potente per: - l'analisi di diversi aspetti della funzione genica in vivo - dissezionare la funzione di componenti specifici di processi biologici complessi - ottenere modelli murini di malattie ereditarie umane • È possibile produrre alterazioni geniche specifiche, da mutazioni puntiformi fino a estesi riarrangiamenti cromosomici • Recenti sviluppi: è possibile generare knockout condizionali o gene targeting inducibili in precisi tessuti o in stadi definiti di sviluppo • Basato su costrutti contenenti cassette selezionabili, introdotti in cellule ES

Ripasso Ricombinazione omologa: i concetti chiave

The positive–negative selection procedure used to enrich for ES cells containing a targeted disruption of gene X. a, The replacement-type vector contains an insertion of neor in an exon of gene X and a linked HSV-tk at one end. Homologous recombination between the targeting vector and the cognate chromosomal gene results in the disruption of one genomic copy of gene X and the loss of the vector's HSV-tk. Cells in which this event has occurred will be X+/-, neor+, HSV-tk- and will be resistant to both G418 and FIAU. b, Integration of the targeting vector at a random site of the ES cell genome by non-homologous recombination. Because non-homologous insertion of exogenous DNA into the chromosome occurs through the ends of the linearized DNA, HSV-tk will remain linked to neor. Cells derived from this type of recombination event will be X+/+, neor+, HSV-tk+ and therefore resistant to G418 but killed by FIAU. The nucleoside analog FIAU specifically kills cells with functional HSV-tk genes, but is not toxic to cells with only cellular Tk. Capecchi, 2002

Generation of mouse germline chimeras from ES cells containing a targeted mutation. a, The first step involves the isolation of a clonal ES cell line containing the desired mutations. Positive–negative selection is used to enrich for ES cells containing the desired modified gene. b, The second step is to use those ES cells to generate chimeric mice able to transmit the mutant gene to their progeny. To facilitate isolation of the desired progeny, the ES cells and recipient blastocysts are derived from mice with distinguishable coat color alleles (ES, agouti brown mice; blastocyst, black mice). This permits evaluation of the extent of chimerism by coat color chimerism and evaluation of ES cell contribution to the formation of the germ line by the coat color of the progeny derived from the chimeric animals. Capecchi, 2002

POTENZIALI PROBLEMI • Knockout incompleto Prima di analizzare il fenotipo mutante, si deve verificare che non vi sia proteina residua espressa dal locus inattivato. - "leaky mutation" con espressione residua di proteina (hypomorphs) (promotori criptici/alternativi, read-through transcription, traduzione da AUG criptici, aberrant splicing) - presenza di polipeptidi tronchi (possono acquisire nuove proprietà, es. dominant negative) Alcuni di questi knockout incompleti costituiscono varianti alleliche con fenotipi interessanti (es. rescue parziale di un fenotipo letale, possono rivelare funzioni di un gene inaspettate; es. N-myc) • Rimozione di sequenze codificanti o di elementi regolatori di altri geni La rimozione di tutti gli esoni codificanti di un gene da inattivare può evitare il problema di espressione residua di proteina. Però la generazione di ampie delezioni genomiche può provocare effetti inattesi: - perdita di geni non identificati (all'interno di introni, o codificati dallo strand opposto) - perdita di elementi. regolatori che controllano l'espressione di altri geni (es. MRF4 e MRF5, CD3 e Oct-1) • Interferenza da parte della cassetta selezionabile Il promotore forte che guida l'espressione del marker neoR può interferire con l'espressione di geni vicini. Può essere evitato rimuovendo la cassetta dopo la ricombinazione omologa.

COME INTERPRETRARE IL FENOTIPO DI UN KNOCKOUT?: PROBLEMI…

IL CONTROLLO SPAZIALE E TEMPORALE DELLA ESPRESSIONE GENICA IL SISTEMA CRE-LOX

CONDITIONAL GENE TARGETING Gene targeting standard: inattivazione di un gene in tutti i tessuti del corpo dall'inizio dello sviluppo e per tutta la vita. Gene targeting condizionale: permette di controllare inattivazione genica in modo definito per un certo tessuto o un certo stadio di sviluppo. Particolarmente utile quando inattivazione completa determina fenotipo letale. Se un gene ha un pattern di espressione complesso, inattivazione tessuto-specifica permette di definire il ruolo del gene in un certo tessuto, senza compromettere le altre funzioni nell'organismo. • Tissue-specific knockout a) generazione di topi transgenici che esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo di promotore tessuto-specifico. b) generazione di topi con siti loxP fiancheggianti il gene da inattivare. Incrocio topi a) x b) : topi dove gene di interesse è stato inattivato solo nelle cellule in cui Cre è espresso. Database di linee di topi transgenici Cre: http///www.mshri.on.ca/develop/Nagy/Cre.htm • Inducible gene targeting Controllo della funzione genica in maniera tempo-dipendente. Uso di sistema di ricombinazione basato su Cre-ER, che e’ “attivabile” con il tamoxifene

Un caso pratico…. Diapo tesi elena

Controllo TEMPORALE!

Riflettiamo un attimo… L'uso di topi knockout e' ovvio per studiare la funzione di un gene in tutta la vita, in tutti i tessuti e quando mi interessa il suo LOSS OF FUNCTION. L'uso di Knockout condizionali permette di focalizzare l'attenzione su particolari tessuti oppure a partire da un momento ben preciso definito dal ricercatore. Detto cio', molte malattie sono dovute a mutazioni puntiformi, alleli neomorfici etc etc, basti pensare al ruolo di oncogeni attivati nel cancro…

Knock-out (KO) vs knock-in NON esiste alcuna differenza pratica. Cambia lo scopo: con il KO INATTIVO un gene. Con il Knock-in realizzo una ricombinazione omologa con lo scopo di introdurre variazioni piu' fini, per esempio mutazioni a livello di specifici aminoacidi, piccole delezioni di enhancers etc

DOMANDA: Con il sistema cre-lox inattivo un gene (ovvero ne “faccio un Knockout”, se condizionale, in un tessuto a piacere etc). Ma sei io volessi attivare l’espressione in una forma mutante di gene endogeno in certo tessuto? Risposta: E' possibile, realizzanto il knock-in della forma mutata, con l’accortezza di utilizzare delle cassette di STOP trascrizionali (transcriptional stop cassette (che sono delle sequenze contenti codoni stop in tutti I frames di lettura + con vari siti che dirigono la polyadenilazione del trascritto nascente)

Generazione di un modello di cancro del pancreas umano Espressione pancreas specifica delle segueniti Mutazioni, da combinare assieme: mutazione PUNTIFORME di p53 (neomorfica) Mutazione attivante dell'oncogene RAS (G12V) NB NON TRANSGENICI, MA ESPRESSI DAL LORO PROMOTORE, COME AVVIENE NELLA MALATTIA UMANA!!! SPATIAL CONTROL OF KNOCK-OUT

INTRODUZIONE DI ACIDI NUCLEICI IN CELLULE COLTIVATE IN VITRO

La manipolazione sperimentale dell'espressione genica (esperimenti di gain e loss of function) passa quasi invariabilmente per la capacita' di introdurre DNA o RNA in cellule eucarioti DNA Plasmidico (esprimente un gene sotto un promotore forte; esprimente un gene reporter sotto un promotore di un gene eucariotico oppure sotto un promotore sensore di una certa via di trasduzione; un shRNA per loss of function etc) mRNA microRNA siRNA

L'introduzione di acidi nucleici nella cellula bersaglio attraverso la membrana plasmatica avviene attraverso TRASFEZIONE (transfection) (DNA complessato con Calcio fosfato o liposomi, oppure RNA con liposomi). E in alcuni cas (ES!) mediante elettroporazione. MICROINIEZIONE VETTORI VIRALI, Tipicamente (90%) retrovirus o lentivirus ma anche adenovirus (N.B: i retrovirus saranno trattati a breve nella lezione della terapia genica)

TRASFERIMENTO DI MATERIALE GENETICO IN CELLULE EUCARIOTICHE

Microiniezione

La Microiniezione Vantaggi: Consente di introdurre nella cellula qualunque molecola Consente di introdurre quantita’ ben definite di materiale nelle cellule In grandi cellule consente di introdurre degli RNA o delle proteine in modo localizzato Consente di individuare le cellule che hanno ricevuto l’iniezione, mediante la co-iniezione di lineage tracers (ad es. sostanze fluorescenti) Consente di fare penetrare del materiale genetico in vivo in modo localizzato (ad e. in singoli miotubi di un muscolo) Svantaggi: Richiede una apparecchiatura costosa Richiede molto tempo per iniettare un numero elevato di cellule Le cellule iniettate possono morire in conseguenza della perdita del citoplasma dal foro prodotto dall’ago. Alcune cellule, come i neuroni, sono ipersensibili alla microiniezione. Cellule troppo piccole non possono essere iniettate senza indurne la morte

LA TRASFEZIONE

Uno sguardo ad un tipico vettore di espressione per cDNA in eucarioti

I principali metodi trasfezione consistono nell’”impacchettare” le macromolecole di interesse (DNA, RNA o proteine) in complessi con delle sostanze “carrier”. Le macromolecole cosi’ complessate vengono somministrate alle cellule, che le inglobano tramite gli endosomi. Qui le macromolecole vengono liberate dal “carrier”. La membrana dell’endosoma viene poi ad essere distrutta dalla cellula, liberando le macromolecole nel citoplasma.

Metodi di trasfezione del DNA

La Trasfezione: i Liposomi In vivo liposome gene delivery. (A) and (B) Structure of liposomes. Liposomes are synthetic vesicles which can form spontaneously in aqueous solution following artificial mixing of lipid molecules. In some cases, a phospholipid bilayer is formed, with hydrophilic phosphate groups located on the external surfaces and hydrophobic lipids located internally (left). In other cases there is a multilamellar lipid envelope. Anionic liposomes have a negative surface charge and when the lipid constitutents are mixed with negatively charged DNA molecules (see panel C below), the DNA is internalized. Cationic liposomes have a surface positive charge and DNA molecules bind to the surface of liposomes. (C) Use of liposomes to transfer genes into cells. This figure illustrates the use of anionic liposomes to transfer internally located DNA into cells. The plasma membranes of cells are fluid structures whose principal components are phospholipids, and so mixing of cells and liposomes can result in occasional fusion between the lipid bilayer of the liposome and the plasma membrane. When this happens the cloned genes can be transferred into the cytoplasm of a cell, and can thence migrate to the nucleus by passive diffusion through the pores of the nuclear envelope. Note that, in practice, cationic liposomes have been more widely used for transferring DNA into cells.

La Trasfezione funziona molti tipi cellulari, ma richiede che le cellule attivamente incapsulino I materiali da trasfettare (DNA, RNA o proteine) negli endosomi. Se questo non avviene (es. Le cellule ES) e’ necessario ricorrere a tecniche alternative.

La Trasfezione: elettroporazione