TBC, "the reemergent killer" aumento della tubercolosi nei paesi industrializzati crescente diffusione dei ceppi di M. tuberculosis multiresistenti (MRMT)

la diagnostica tradizionale esame microscopico esame colturale identificazione antibiogramma

esame microscopico colorazione di Ziehl-Neelsen fluorescenza tecnica scarsamente sensibile e non specie-specifica

Ziehl-Neelsen 1000x

fluorescenza 400x

metodi colturali "alternativi" metodo radiometrico terreno bifasico terreno con indicatore fluorescente terreno Redox

il metodo radiometrico flaconcini sigillati di terreno liquido contenente un substrato (ac. palmitico) marcato con 14C miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni liberazione di CO2 radiomarcata ad opera del metabolismo batterico rilevamento di radioattività nella fase gassosa come spia di batteri metabolicamente attivi notevole accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

il terreno bifasico flacone di terreno liquido per micobatteri miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni slide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo, agarizzato, agar cioccolato) arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie isolate sul terreno solido moderato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

medium con indicatore fluorescente provetta di terreno liquido per micobatteri miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni fluorocromo, incorporato in un film di silicone sul fondo della provetta, sensibile alle variazioni del contenuto di ossigeno comparsa di fluorescenza per effetto del consumo di ossigeno operato dal metabolismo batterico rilevamento della fluorescenza visivo, sotto una lampada UV automatizzato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

il terreno Redox i micobatteri crescono nel terreno liquido di Kirchner formando piccoli fiocchi o intorbidamento uniforme i sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono ridotti a formazzano dai micobatteri in crescita il formazzano, rosa-violetto ed insolubile, si fissa alla superficie delle colonie micobatteriche permettendone il riconoscimento

automazione nella coltura dei micobatteri metodo radiometrico la produzione di CO2 radiomarcata viene rilevata da un -counter metodo pressometrico l’aumento di pressione, dovuto a produzione di CO2, viene rilevato da un manometro metodo fluorimetrico la fluorescenza di un indicatore, inibita dalla presenza di ossigeno nel terreno, viene ripristinata per effetto del consumo di ossigeno metodo refrattometrico la produzione di CO2 fa virare un sensore che a sua volta modifica l’intensità di un raggio di luce riflessa 2

l’emocoltura per micobatteri 1 la ricerca dei micobatteri nel sangue è giustificata per i pazienti immunodepressi nei quali può essere richiesta anche la mielocoltura la bassa sensibilità rende inutile l’esecuzione dell’esame microscopico un tipo particolare di emocoltura è quello che si esegue sul sangue mestruale quando si sospettano forme tubercolari a carico dell’apparato genitale

l’emocoltura per micobatteri 2 semina diretta del sangue nei flaconi Bactec 13A nei flaconi BacT ALERT MB blood nelle bottiglie Bactec MYCO/F Lytic semina dopo lisi-centrifugazione (sistema Isolator) su tutti i terreni solidi (a base di uovo o sintetici) in tutti i terreni liquidi compresi quelli, non dedicati alle emocolture, impiegati dai sistemi automatizzati nel terreno bifasico

l’emocoltura per micobatteri 3 la sensibilità dei terreni solidi è notevolmente inferiore a quella dei terreni liquidi tempi di incubazione inferiori alle otto settimane sono sconsigliati anche per i terreni liquidi le specie appartenenti al MAC sono di gran lunga quelle di più frequente reperimento lo sviluppo di micobatteri in terreno liquido che non crescono nelle subcolture su terreno solido deve far pensare alla presenza della specie M. genavense

identificazione tradizionale, test biochimici accumulo di niacina riduzione dei nitrati catalasi quantitativa termoresistente idrolisi del Tween 80 ureasi arilsolfatasi riduzione del tellurito

identificazione tradizionale, test colturali velocità di crescita aspetto delle colonie rugose lisce fotocromogene scotocromogene non pigmentate crescita a varie temperature test di inibizione selettiva

NAP test il p-nitro-acetil-amino-idrossi-propriofenone (NAP), aggiunto al terreno di coltura, inibisce lo sviluppo dei micobatteri appartenenti al M. tuberculosis complex ma non quello dei micobatteri non tubercolari risultati accettabili solo in terreno liquido test di screening rapido (4-7 gg)

metodi di identificazione “alternativi” DNA probe HPLC degli acidi micolici sequenziamento genico 16S rDNA SOD HSP65 4

il sistema AccuProbe lisi delle cellule batteriche e liberazione del rRNA probe marcato costituito da un frammento di DNA a filamento singolo contenente una sequenza specie-specifica presente in una regione ipervariabile del rRNA ibridizzazione in presenza di complementarità fra rRNA e probe rimozione della marcatura dal DNA non ibridizzato eccitazione della molecola marcatrice chemioluminescente rilevamento della luce prodotta in presenza di molecole ibride di acidi nucleici metodo rapido (2 h) altamente specifico

HPA (hybridization protection assay) gli esteri di acridinio utilizzati come marcatori emettono luce se eccitati chimicamente nel DNA a catena singola la molecola marcatrice è esposta all'azione di eventuali agenti inattivanti la struttura assunta dall'acido nucleico a catena doppia protegge la molecola marcatrice dall'azione di eventuali agenti inattivanti l'aggiunta di agenti inattivanti elimina ogni possibilità di emissione di segnale da parte di molecole non ibridizzate, l'emissione di luce è pertanto indice di avvenuta ibridizzazione

Line Probe Assay (LiPA)

LiPA, interpretazione

gli acidi micolici acidi grassi, ramificati in posizione  presenti nella parete batterica dei generi: Corynebacterium: 22-38 atomi di C Rhodococcus: 34-52 atomi di C Nocardia: 44-60 atomi di C Gordona: 48-66 atomi di C Tsukamurella: 64-78 atomi di C Mycobacterium: 60-90 atomi di C presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega' metossi-

HPLC degli acidi micolici saponificazione, estrazione e derivatizzazione degli acidi micolici presenti nella parete dei micobatteri frazionamento mediante HPLC individuazione dei picchi presenti nel tracciato cromatografico e identificazione per confronto con profili di riferimento

profilo HPLC del M. tuberculosis complex ad eccezione del M. bovis BCG SI

esempi di profili HPLC SI

TLC degli acidi micolici

gas-cromatografia

RNA ribosomiale 16S

antibiogramma i farmaci antitubercolari maggiori il principio del metodo delle proporzioni l’antibiogramma manuale l’antibiogramma automatizzato l’antibiogramma sui micobatteri non tubercolari

antibiogramma radiometrico inoculo di una serie di flaconcini radiometrici, addizionati con antibiotici, con una sospensione micobatterica standardizzata inoculo di un flaconcino di controllo con una diluizione 1/100 della sospensione precedente lettura radiometrica giornaliera fino al raggiungimento, da parte del controllo, di una soglia prefissata sensibilità flaconcini con incremento giornaliero inferiore a quello del controllo resistenza flaconcini con incremento giornaliero superiore a quello del controllo metodica di riferimento, durata 5-10 gg

le fasi della Polymerase Chain Reaction pretrattamento del materiale e liberazione dell'acido nucleico fluidificazione ed eventuale decontaminazione lavaggio lisi delle cellule amplificazione dell'acido nucleico rilevamento dell'amplificato

componenti principali della miscela di amplificazione NUCLEOTIDI PRIMER: oligonucleotidi complementari di sequenze presenti alle due estremità della regione da amplificare POLIMERASI: enzima che determina l'allungamento dei primer utilizzando i nucleotidi presenti nella miscela di reazione

i componenti della Mastermix del sistema Amplicor M. tuberculosis NUCLEOTIDI assenza di nucleotidi contenenti timina (sostituiti da quelli contenenti uracile) PRIMER complementari di sequenze che delimitano una regione del genoma specifica del genere Mycobacterium marcati con biotina POLIMERASI Taq polimerasi

il sistema AmpErase per la prevenzione delle contaminazioni il DNA-target non contiene uracile il DNA-amplificato contiene uracile al posto della timina l'aggiunta di uracil-N-glicosilasi al materiale da amplificare determina la distruzione di qualsiasi traccia di DNA contaminante (frutto di precedenti amplificazioni); l'enzima è invece del tutto inattivo sul DNA-target

i cicli termici della reazione di amplificazione 20 sec a 94°C: la doppia elica del DNA si separa ed i filamenti singoli costituiscono lo stampo per successive amplificazioni 20 sec a 62°C: i primer si legano alle sequenze complementari presenti sul DNA-target (annealing) 45 sec a 72°C: la polimerasi determina l'allungamento dei primer utilizzando i nucleotidi presenti nella miscela di reazione 30 cicli (ne sono previsti 35) determinano la formazione di un miliardo di copie del DNA originale

il rilevamento dell'amplificato trasferimento dell'amplificato in un pozzetto di una piastra microtiter, coated con probe complementari di una sequenza dell'amplicone specifica per il M. tuberculosis incubazione (ibridizzazione) lavaggi (eliminazione dell'amplificato non ibridizzato) aggiunta del coniugato avidina-enzima incubazione (legame avidina-amplicone biotinilato) lavaggi (eliminazione del coniugato non legato) aggiunta del substrato incubazione (reazione enzimatica) bloccaggio della reazione enzimatica lettura fotometrica a 450 nm

Transcriptase Mediated Amplification le fasi della Transcriptase Mediated Amplification fluidificazione e decontaminazione del campione lisi (ultrasuoni) delle cellule trasferimento del lisato in provette contenenti la miscela di amplificazione e breve incubazione a 95°C aggiunta della miscela enzimatica e amplificazione isotermica (2 h a 42°C) di una regione del rRNA specifica del genere Mycobacterium blocco dell'amplificazione ed ibridizzazione dell'eventuale amplificato con un DNA-probe specifico per il M. tuberculosis complex rilevamento HPA dell'eventuale ibridizzazione

il principio della TMA annealing dei primer, presenti nella miscela di reazione, con il rRNA liberato mediante lisi cellulare sintesi di DNA a partire da RNA grazie alla transcriptasi inversa separazione dell'ibrido DNA-RNA ad opera della RNasi utilizzo del DNA come stampo per la sintesi di molte copie di RNA ad opera della polimerasi ulteriore annealing del RNA sintetizzato con nuovi primer non occorrono cicli termici perché manca la fase di denaturazione formazione di 10 miliardi di copie in 2 ore

la Strand Displacement Amplification TARGET: IS6110 PRINCIPALI COMPONENTI DELLA MISCELA DI AMPLIFICAZIONE: bamper primer polimerasi enzima di restrizione sito di restrizione bamper primer 5’ 3’ target non occorrono cicli termici perché manca la fase di denaturazione

SDA: amplificazione esponenziale

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

il rilevamento dell’amplificato nella SDA

ricerca del M. tuberculosis mediante amplificazione, pro e contro rapidità metodiche in-house elevata sensibilità manualità complessa alto rischio di contaminazioni metodiche commerciali sensibilità non superiore a quella della coltura parzialmente automatizzabili minimo rischio di contaminazioni standardizzate solo per i materiali respiratori 7

indicazioni delle tecniche di amplificazione utilizzabili per la ricerca di nuovi casi non utilizzabili per il monitoraggio della terapia 8

interpretazione del risultato dell’amplificazione 1 Microscopia POS Amplificazione POS M. tuberculosis Microscopia NEG Amplificazione NEG probabile NEG probabile probabile MOTT

interpretazione del risultato dell’amplificazione 2 Coltura POS Amplificazione POS M. tuberculosis Coltura NEG Amplificazione NEG NEG ??? M. tuberculosis o MOTT