Studio SAS dell’equilibrio monomero-dimero della ß-lactoglobulina Dottoranda: Maria Grazia Ortore Tutore: Prof. Giuseppe Onori Seminario XVIII Ciclo Dottorato in Fisica-Universita’ di Perugia

Struttura delle proteine La catena peptidica è costituita da 20 tipi di aminoacidi (a) Struttura primaria (b) Struttura secondaria  elica foglietto  (c) Struttura terziaria (d) Struttura quaternaria dominio sequenza funzionalità conformazione

Protein Unfolding: perchè usare la pressione? 1895 Royer scoprì che un’elevata pressione idrostatica può inibire la crescita di batteri. 1899 Hite utilizza la pressione per la conservazione del latte. 1914 Bridgman nota che il bianco dell’uovo sembra cotto dopo un trattamento in pressione. Benché non sia intuitivo, anche le proteine denaturano con la pressione. Questa modifica la compressibilità, il volume, la flessibilità e di conseguenza la funzionalità della proteina.

Agenti chimici denaturanti Trattamento in pressione Trattamento termico a basse concentrazioni hanno un effetto indiretto modificando le caratteristiche del solvente ad alte concentrazioni possono rompere i ponti salini (acidi), i legami idrogeno e disolfuro (urea) modificano l’attività enzimatica le eccitazioni termiche modificano le interazioni si modifica la cinetica agisce fondamentalmente modificando i volumi

Panorama termodinamico Capacità termica Cp = (dH/dT)p kT Cp = T<S-<S>>2 Fattore di compressibilità b = -1/V(dV/dp)T kT bV= <V-<V>>2 Fattore di espansione a = -1/V(dV/dT)p kT aV = <SV-<S><V>>2 Teoria di Hawley DG = GU-GN DG = DG0– DS0(T-T0) – DCp[(T-T0)+ln(T/T0)]+ DV0(p-p0) + Db/2(p-p0)2 + Da(p-p0)(T-T0) P T DS=0 DV=0 DG=0 Smeller (BBA 2002)

Quali tecniche usare? Vantaggi del SAS: perturbo poco il sistema ottengo informazioni sia sulle caratteristiche strutturali, sia sulle interazioni in condizioni sperimentali molto diverse (pH, temperatura, pressione, forza ionica)

SANS o SAXS? SANS SAXS Densita’ di lunghezza di scattering isotopico b e magnetico B Densita’ elettronica Sorgenti dal flusso debole Alta brillanza delle sorgenti 0.210 Angstrom 0.52 Angstrom Diversi segnali da H e da D Poca visibilita’ degli H Bassa lunghezza di penetrazione all’interno del campione Possibile danneggiamento del campione

-Lactoglobulina due monomeri costituiti ciascuno da 162 aminoacidi e di peso 18350 Da appartiene alla famiglia delle lipocaline è contenuta nel latte

funzionalità struttura Interazioni proteina-proteina in soluzione Aspetti energetici e geometrici del riconoscimento molecolare

a concentrazione 10mg/ml, pH=2.3 e forza ionica crescente. A temperatura ambiente e pH neutro la -Lg è un dimero (la carica teorica del monomero è –8). A pH acido (condizione fisiologica) si perde la struttura quaternaria, ma i monomeri conservano le proprie caratteristiche strutturali. A pH acido (pH=2.3) una forza ionica variabile è in grado di modificare l’equilibrio monomero-dimero. Curve SAXS per la -Lg a concentrazione 10mg/ml, pH=2.3 e forza ionica crescente. F.I.=7mM Rg=17.9±0.3 F.I.=507mM Rg=20.7±0.3 Macromolecules (1999), 32, 6128-6138

Kratky plot di curve SAXS: Beta-lactoglobulina 10mg/ml pH=2.3 T=20°C F.I.=7-507 mM Frazione di monomeri di beta-lactoglobulina A) in funzione della concentrazione C di proteina stessa (le bande sono ottenute dall’analisi dei coefficienti di diffusione, i punti da dati SAXS) B) in funzione della forza ionica e a C=10mg/ml (le bande sono ottenute da dati SAXS, i punti dall’analisi dei coefficienti di diffusione) Macromolecule (1999), 32, 6128-6138

Approccio teorico alla tecnica SAS: Consideriamo il solvente come un dielettrico continuo ed uniforme e utilizziamo un modello a due ‘macroioni’ Assumiamo interazioni solo a simmetria sferica Richiami alla teoria generale: Sezione d’urto differenziale Utilizzando un modello a due fasi: : contrasto elettronico p:numero di specie di proteine Vi , ni :volume e densità numero della specie iesima Fi (Q) : fattore di forma Sij (Q): fattore di struttura parziale gij (r): funzione di distribuzione di coppia gij (r)=exp(- Wij (r)) Wij (r): potenziale di forza media

Deve esserci un’interazione attrattiva interazione fra le specie i-j interazione fra le specie i-j e le altre macroparticelle in soluzione Potenziale a sfere dure Potenziale Coulombiano KD: lunghezza di schermo di Debye (dipende in maniera nota da forza ionica e controioni)  : costante dielettrica del mezzo Deve esserci un’interazione attrattiva responsabile dell’aggregazione dei monomeri in dimeri contributo non elettrostatico, parametro libero nell’analisi di best fit

Curve SAXS e relativi fit : Beta-lactoglobulina 10mg/ml pH=2.3 T=20°C Funzioni di distribuzione di coppia risultanti dall’analisi delle curve SAXS. A sinistra approssimazione ordine 0, a destra di ordine 1. Puntini: monomero monomero, tratteggio: monomero dimero, linea: dimero dimero. Biophysical Journal (2002) , 82, 2165-2175

Ethylene Glycol: HOCH2CH2OH

Andamento della costante dielettrica in funzione della percentuale di glicol-etilenico in soluzione

Esperimenti preliminari pH=2.3 forza ionica: 0÷200 mM glicol etilenico: 0÷50% w/w T=10÷50°C P=1÷1800 bar Analisi preliminare : approssimazione di Guinier Valida per con Ad esempio per una sfera di raggio R : ~

Cella a pressione ad Elettra (Trieste) A termocoppia B cella a pressione dove arriva il fascio C sensori per la pressione D valvola pneumatica che equilibra i due circuiti a pressione E valvola a doppio braccio F pompa per generare alte pressioni G motore per la pompa

Studio in pressione in presenza di solvente organico

Cella a pressione : 1÷7Kbar Esperimento in preparazione: SANS Cella a pressione : 1÷7Kbar LABORATOIRE LEON BRILLOUIN ,Saclay, France

Esperimenti futuri Verificare quanto sia significativo il parametro r utilizzando alcool in diversa percentuale come solventi; Analizzare il panorama sperimentale a pressioni piu’ elevate; Migliorare il metodo di analisi dati.