Enzimi

“Proteine che agiscono da catalizzatori biologici aumentando enormemente la velocità delle reazioni biochimiche”

PROPRIETÀ DEGLI ENZIMI Alta specificità dotati di elevatissimo grado di specificità, maggiore di qualunque catalizzatore chimico Alta velocità di reazione aumentano la velocità di reazione fino a 1012 volte rispetto alla stessa reazione non catalizzata da enzimi Capacità di regolazione inibizione a feedback, controllo allosterico, modificazione covalente, variazioni della quantità di enzima Agiscono in condizioni moderate temperature inferiori a 100 °C, pressione atmosferica, pH neutro Catalizzatori in grado di catalizzare molte volte la stessa reazione senza produrre sottoprodotti indesiderati

Sintesi proteica OLOENZIMA Apoenzima (inattivo) Zimogeno Apoenzima (precursore) Apoenzima (parte proteica) gruppo prostetico (legato covalentemente) OLOENZIMA Apoenzima (inattivo) ione metallico coenzima (vitamina)

Coenzimi Coenzima Precursore Biocitina Biotina 5‘-Deossiadenosilcobalamina Vitamina B12 Flavin adenin dinucleotide Riboflavina (B2) Acido lipoico Acido lipoico Nicotinamide adenin dinucleotide Ac. Nicotinico Piridossal fosfato Piridossina (B6) Tetraidrofolato Folato Tiamin pirofosfato Tiamina (B1)

Elementi inorganici che servono come cofattori di enzimi Cu2+ Citocromo ossidasi Fe2+ o Fe 3+ Catalasi, perossidasi K+ Piruvato cinasi Mg2+ Esochinasi, glucosio-6-fosfatasi Mn2+ Arginasi Mo Dinitrogenasi Ni2+ Ureasi Se Glutatione perossidasi Zn2+ Anidrasi carbonica, alcool deidrogenasi

Velocità delle reazioni X + Y Z La velocità di una reazione varia con la temperatura secondo l’equazione di Arrehenius: Velocità = Ae - Ea/RT Dove A è la costante nota come fattore pre-esponenziale, correlata alla frequenza con cui le molecole si urtano con il giusto orientamento ed alla probabilità che la collisione avvenga con un’energia sufficiente a far avvenire la reazione, Ea rappresenta l’energia di attivazione (J mol-1), R la costante dei gas (J mol-1K-1) e T la temperatura assoluta

ENERGIA DI ATTIVAZIONE La conversione S --> P è termodinamicamente favorevole (P si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a S), ma la reazione non può avvenire se S non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione Stato di transizione S P Energia Coordinte di reazione ENERGIA DI ATTIVAZIONE Ea

Come agiscono gli enzimi? Si combinano transientemente con il substrato e ne abbassano l’energia di attivazione Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili per catalizzare una nuovo ciclo di reazione

Distribuzione delle energie cinetiche Molecole con valori medi di energia Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione catalizzata da un enzima Numero di molecole Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione non catalizzata Energia cinetica delle molecole

S P E + S ES EP E+ P Reazione non catalizzata Reazione catalizzata da un enzima E + S ES EP E+ P

Profilo energetico di una reazione catalizzata da un enzima Stato di transizione Eatt (non enzimatica) Stato di transizione Energia Eatt (enzimatica) E + S Stato di transizione ΔG° ES E + P EP Coordinate di reazione

Misura dell’attività enzimatica Mi permette di determinare la quantità di enzima presente in un campione Solitamente si sfrutta la proprietà intrinseca dell’enzima di catalizzare una reazione

Supponiamo di voler determinare la quantità di Lattico deidrogenasi (LDH) presente nel sangue di un paziente LDH Piruvato + NADH Lattato + NAD+ 340 nm ABS NADH NAD+ Lunghezza d’onda

Cuvetta (quarzo-vetro-plastica) Preparazione test Tampone Substrato Cuvetta (quarzo-vetro-plastica) Miscela tampone-substrato

Scelta della lunghezza d’onda 1 2 3 4 5 6 7 8 9 START STOP

Spettrofotometro 340 nm 0.000 Lunghezza d’onda ABS minuti 2.000 1.000 1 2 minuti

Posizionamento della cuvetta nello spettrofotometro

ABS 340 nm 1.546 2.000  1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000   1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000    1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000     1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000      1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000       1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000        1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000         1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000          1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000           1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000            1.000 0.000 1 2 minuti

ABS 340 nm 1.546 2.000             1.000 0.000 1 2 minuti

             ABS 340 nm 1.546 minuti 2.000 1.000 0.000 1 1 2 minuti

Aggiunta dell’enzima (cofattore o substrato) Rapido mescolamento

             Inizia la reazione enzimatica ABS 340 nm 1.546 2.000              1.000 0.000 1 2 minuti Inizia la reazione enzimatica

              ABS 340 nm 1.516 minuti 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti

               ABS 340 nm 1.493 minuti 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti

                ABS 340 nm 1.479 minuti 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti

                 ABS 340 nm 1.449 minuti 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti

                  ABS 340 nm 1.411 minuti 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti

                   ABS 340 nm 1.390 minuti 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti

                    ABS 340 nm 1.343 minuti 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti

                     ABS 340 nm 1.317 minuti 2.000                      1.000 0.000 1 2 minuti

                      ABS 340 nm 1.289 minuti 2.000                       1.000 0.000 1 2 minuti

                       ABS 340 nm 1.274 minuti 2.000                        1.000 0.000 1 2 minuti

                        ABS 340 nm 1.245 2.000                         1.000 0.000 1 2 minuti

                         ABS 340 nm 1.224 2.000                          1.000 0.000 1 2 minuti

                          ABS 340 nm 1.189 2.000                           1.000 0.000 1 2 minuti

                           ABS 340 nm 1.156 2.000                            1.000 0.000 1 2 minuti

                            ABS 340 nm 1.123 2.000                             1.000 0.000 1 2 minuti

                             ABS 340 nm 1.098 2.000                              1.000 0.000 1 2 minuti

                              ABS 340 nm 1.053 2.000                               1.000 0.000 1 2 minuti

                               ABS 340 nm 1.012 2.000                                1.000 0.000 1 2 minuti

                                ABS 340 nm 0.994 2.000                                 1.000 0.000 1 2 minuti

                                 ABS 340 nm 0.964 2.000                                 1.000  0.000 1 2 minuti

                                  ABS 340 nm 0.938 2.000                                 1.000   0.000 1 2 minuti

                                  ABS 340 nm 0.910 2.000                                 1.000   0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.889 2.000                                 1.000    0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.868 2.000                                 1.000     0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.861 2.000                                 1.000      0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.844 2.000                                 1.000       0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.821 2.000                                 1.000        0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.803 2.000                                 1.000         0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.789 2.000                                 1.000          0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.777 2.000                                 1.000           0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.759 2.000                                 1.000            0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.719 2.000                                 1.000             0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.690 2.000                                 1.000              0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.657 2.000                                 1.000               0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.634 2.000                                 1.000                0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.611 2.000                                 1.000                 0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.592 2.000                                 1.000                  0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.558 2.000                                 1.000                    0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.528 2.000                                 1.000                      0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.499 2.000                                 1.000                       0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.459 2.000                                 1.000                        0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.425 2.000                                 1.000                          0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.399 2.000                                 1.000                           0.000 1 2 minuti

                                   ABS 340 nm 0.384 2.000                                 1.000                             0.000 1 2 minuti

La registrazione viene bloccata ABS 340 nm 0.380 2.000                                 1.000                               0.000 1 2 minuti La registrazione viene bloccata

Determinazione dell’attività enzimatica ABS 340 nm 0.380 2.000                                 1.000                               0.000 1 2 minuti

? Occorre calcolare la velocità della reazione Se vengono rispettate determinate condizioni, la velocità della reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima ?

In condizioni di stato stazionario k1 k3 E + S ES E + P k2 k1 >> k2 Velocità= k3[ES] k1 ≥ k3 se la concentrazione di substrato è sufficientemente elevata [E]  [ES]

In condizioni di stato stazionario k1 k3 E + S ES E + P k2 Fino a quando [E] >>[S] V = costante V = k3[ES]  [E] k1 >> k2 k1 ≥ k3

Andamento della velocità iniziale in funzione della concentrazione di substrato • [S] Vo V max L’equazione matematica che esprime la relazione iperbolica tra la velocità iniziale e la concentrazione del substrato viene detta equazione di Michaelis-Menten ½ Vmax v = Vmax [S] Km [S] Km

Determinazione dell’attività enzimatica ABS 340 nm 0.380 2.000 Pendenza A/min                                 1.000                               0.000 1 2 minuti

Determinazione dell’attività enzimatica ABS 340 nm 0.380 2.000 Velocità costante                                 1.000                               0.000 1 2 minuti

In condizioni di [S] saturanti ABS 340 nm 0.380 2.000               La velocità della reazione non aumenta all’aumentare della concentrazione di substrato                   1.000                               0.000 1 2 minuti In tali condizioni la velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima

Determinazione dell’attività enzimatica Variazione di assorbimento Volume totale test A Vtot Unità enzimatiche UI =  d t Vc Volume enzima Coefficiente di estinzione (mM o M) del substrato Tempo Cammino ottico

L’attività di un enzima viene misurata in termini di “Unità enzimatiche” o “Unità Internazionali” “Unità enzimatica” Quantità di enzima capace di trasformare una micromole (mole) di substrato in un minuto per ml di soluzione

In condizioni di [S] saturanti 1 unità di enzima Velocità 2 unità di enzima 3 unità di enzima Tempo Incrementando la concentrazione di enzima aumenta la pendenza della retta

Metodi Continuo A tempo fisso L’operatore segue la reazione “in tempo reale”: è possibile capire se stiamo eseguendo effettivamente una misura di velocità iniziale  la velocità enzimatica deve rimanere costante. In tali condizioni la velocità di reazione risulta direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima da misurare L’operatore fa partire la reazione e la blocca dopo un periodo di incubazione prescelto  è essenziale che durante tale periodo la reazione sia di ordine zero relativamente alla concentrazione del substrato e la velocità enzimatica sia quindi sempre massima

Continuo ABS ABS v0 v0 Tempo Tempo ABS v0 Tempo Problemi di mescolamento, effetto diluizione…. ABS Soluzione concentrata di enzima v0 Tempo

A tempo fisso v0 ABS ABS v0 Tempo Tempo v0 Tempo STOP ABS ABS STOP v0 Tempo Tempo STOP Elevata concentrazione di enzima v0 Campione non mescolato, precipitato….. Tempo

Tipologia di analisi Test accoppiato: Test semplice: Si rende necessario quando nessuno dei composti che prendono parte o si formano nella reazione enzimatica può essere sfruttato per seguire l’andamento della reazione. Occorre accoppiare la reazione “primaria” con una seconda reazione definita “indicatrice” Test semplice: Nella soluzione di reazione è presente un solo enzima. La reazione può essere seguita monitorizzando la scomparsa del substrato, la formazione del prodotto, le variazioni spettroscopiche di qualche coenzima (NADH, NADPH per esempio)

Test ottico semplice (test di Warburg) deidrogenasi A + NADH + H+ B + NAD+ 340 nm ABS NADH o NADPH NAD+ o NADP+ Lunghezza d’onda

Test ottico accoppiato A + B C + D enzima deidrogenasi D + NADH + H+ E + NAD+ creatinfosfocinasi Creatinfosfato+ ADP Acido piruvico + ATP esocinasi Glucosio + ATP Glucosio-6-P + ADP Glucosio-6-P deidrogenasi Glucosio-6-P + NADP+ Acido lattico + NADPH + H+

Per effettuare un dosaggio enzimatico in maniera corretta occorre: Uniformare la temperatura (30°C) Scegliere il valore di pH ottimale Escludere la presenza di inibitori (reversibili o irreversibili)