Metabolismo Batterico Trasformazioni chimiche e chimico-fisiche il cui scopo finale è la creazione di una nuova cellula Per tutte le 1. energia ATP funzioni 2. precursori delle macromolecole (zuccheri, aa, acidi grassi) Funzioni genetiche replicazione trascrizione traduzione riproduzione proteine RNA DNA

Metabolismo Batterico Per produrre energia i batteri sfruttano : 1 Energia solare  batteri fotosintetici 2 Energia da sostanze chimiche  batteri chemiosintetici Processi di fosforilazione: ADP  ATP 1 fotosintesi 2 -fermentazione (ossidazione parziale del substrato), - -respirazione aerobia (accettore finale O2) ed anaerobia (accettore finale nitrati, solfati, CO2)

Classificazione Fotoautotrofi (fotosintesi) C da anidride carbonica Fotoeterotrofi (energia da luce) C da composti organici Chemoautotrofi (energia da ox-red) C da anidride carbonica Chemeoeterotrofi (energia da ox-red) C da composti organici

SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO Punto di crescita della parete cellulare Peptidoglicano Membrana citoplasmatica Esterno Sintesi del Peptidoglicano Si verifica in 4 stadi: 1- nel citoplasma I substrati vengono attivati e costruite le unità di peptidoglicano (nucleotide di Park)  UDP-acNMur-AA5 (PEP) 2- a livello di membrana plasmatica Le unità sono attaccate al bactoprenolo NacGlc e la catena di pentaglicina si legano a UDP -acNMur-AA5 -PP 3- a livello di membrana plasmatica Il bactoprenolo trasloca il precusore fuori dalla cellula che viene legato alla catena peptidoglicanica 4- fuori dalla cellula vicino alla m. plasmatica Le catene peptidiche sono legate mediante legame peptidico 3°aa - 4°aa (transpeptidazione catalizzata da PBP) Interno Pentapeptide Bactoprenolo

SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO Transpeptidazione D-Ala D-Ala

Protoplasti e sferoplasti La sintesi di parete può essere inibita (es. lisozima o antibiotici) Protoplasti parete totalmente assente Sferoplasti parete parzialmente assente

Le sintesi macromolecolari la replicazione del DNA Le due catene parentali non si separano completamente La polimerizzazione dei nucleosidi trifosfati avviene per opera della polimerasi Nei batteri: polimerasi I, II e III. Polimerasi III più importante La separazione delle due eliche è catalizzata da topoisomerasi I e girasi La duplicazione comincia dal sito oriC (V=40m/min) ed è semiconservativa

Cellula 1-1,5 mm; DNA lunghezza 1mm; Cellula 1mm, DNA 1m

Le sintesi macromolecolari la sintesi proteica Codon di inizio m-RNA- 30S + t-RNA - f-Met + 50S Codon terminatore Sintesi di proteine costitutiva o inducibile. Regolazione della sintesi proteica

Limiti dell’esistenza batterica pH 5-9: maggioranza batteri Thiobacillus thiooxidans pH 0.5 ox H2S  acido solforico E.faecalis, Bacillus circulans pH 10-11

EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE DI NaCl SULLA CRESCITA Alofilo estremo Alotollerante Alofilo Esempio: Staphylococcus Esempio: Vibrio fischeri Esempio: Halobacterium salinarum aureus Velocità di crescita Non alofilo Esempio: Escherichia coli 0.9% 7% 15% 30%

CONDIZIONI DI CRESCITA Ossigeno Anaerobiosi Co2 Ioni inorganici Temperatura pH NaCl Esoenzimi Terreni liquidi/solidi

Limiti dell’esistenza batterica Umidità: è condizione favorente liofilizzazione Temperatura: 20-45°C mesofili 45-75°C termofili facoltativi 50-75°C termofili obbligati inibiti a 30°C psicrofili NO meccanismi di termoregolazione

Limiti dell’esistenza batterica Pressione atmosferica: batteri barofili? adattati a crescere a pressioni elevate (fondali oceanici) Concentrazione sali: NaCl 0.85% fisiologica 7-8% Stafilococchi 15-25% alofili Pressione osmotica: pochissimi batteri osmofili crescono in presenza di pressione osmotica elevata

Terreni di coltura solidi Agar:polisaccaride estratto da alcune alghe 1-2% gelificazione > 80°C  liquido < 45°C  solido Terreni sintetici Terreni di base addizionati con sostanze naturali La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l’impiego di terreni di coltura . I terreni solidi differiscono dai liquidi solo per lo stato fisico. Solo pochi batteri possiedono enzimi in grado di depolimerizzare l’agar. La superficie è abbastanza solida per consentire manipolazioni, umida per la replicazione, ma non consente il libero movimento. Le maglie sono abbastanza grandi da far passare il nutrimento, ma non i batteri.

Condizioni di incubazione Temperatura ottimale CO2, aerobiosi o anaerobiosi A seconda dell’atmosfera necessaria si asporta l’aria e si aggiungono miscele a diversa conc. di CO2. Per gli aerobi obbligati immissione forzata di aria sterile, altrimente crescono solo negli strati superficiali.

Terreni di coltura liquidi Stessa composizione dei terreni solidi (non contiene agar) Intorbidamento del terreno

CURVA DI CRESCITA DI UNA POPOLAZIONE BATTERICA Fasi della crescita Latenza Esponenziale Stazionaria Morte Conta vitale Torbidità Densità ottica Coltura continua chemostato: in vivo si realizza una condizione simile

Rappresentazione schematica della divisione di cellule bastoncellari o coccoidi I batteri si dividono per scissione binaria Il tempo di divisione (generazione) della cellula batterica è molto variabile e dipende dalla specie e dal terreno di coltura Ad es. E. coli può dividersi ogni 20 min, in una notte oltre 20 generazioni (circa 500 anni per un uomo) M. tuberculosis ha un tempo di generazione di circa 24 ore

In un sistema chiuso, la crescita esponenziale non può continuare per un tempo indefinito. Una singola cellula batterica con un tempo di generazione di 20 minuti produrrebbe, se continuasse a crescere in modo esponenziale per 48 ore, una popolazione il cui peso sarebbe circa 4000 volte il peso della terra, dato particolarmente impressionante se si considera che il peso di una singola cellula batterica è circa 10-12 g.

RIPRODUZIONE PER SCISSIONE SEMPLICE DNA Replicazione del DNA Allungamento della cellula Formazione del setto Generazione cellulare Nella divisione di una cellula batterica non si osserva nulla di paragonabile al complesso apparato mitotico che si osserva nelle cellula superiore tuttavia la ripartizione del materiale genetico tra le cellule figlie non è casuale Cromosoma ancorato alla membrana cellulare Duplicazione punto di attacco Duplicazione del DNA Si forma un complesso d’inizio che si lega ad una sequenza nota come oriC Intervengono almeno 12 proteine La duplicazione è bidirezionale e termina in terC proteine che interagiscono con oriC: DnaA DnaB DnaC SSB GyrA GyrB Primasi DNA pol. RNAsi H DNA ligasi Accrescimento e allungamento cellula partendo dalla porzione centrale, si distanziano i cromonemi Invaginazione della membrana Formazione setto di membrana che si approfonda in maniera centripeta nel citoplasma lungo un asse che nei bacilli è perpendicolare all’asse maggiore e nei cocchi equatoriale . All’interno del setto di membrana si forma un setto di parete che può rimanere a lungo incompleto mantendo rapporti di contiguità. Divisione La membrana plasmatica ha un ruolo fondamentale Completamento del setto con formazione di pareti distinte Separazione della cellula

Le colture isolanti Per disseminazione sul terreno Per diluizione nel terreno (agar-batteri) Mezzi selettivi di isolamento

isolamento

LE BASI FISICHE DELL’EREDITARIETA’ Eredità: stabilità e la variabilità nel vasto assortimento di funzioni fisiologiche che formano le proprietà dei microorganismi. Gene: sequenza di DNA che codifica per un prodotto funzionale o controlla le proprietà di un microorganismo (caratteristiche biochimiche, di patogenicità, di resistenza agli antibiotici, ecc.,). I geni sono localizzati sul cromosoma. Il cromosoma è duplicato prima della divisione cellulare così le cellule figlie ricevono un corredo identico di geni. I geni nel loro insieme costituiscono il genoma e formano il cosiddetto genotipo.

LE BASI FISICHE DELL’EREDITARIETA’ La replicazione del cromosoma è un processo preciso, molto raramente si hanno errori durante la sintesi, (mutazioni, cioè variazioni permanenti della sequenza originale del gene). Nell’Escherichia coli è oltre 3 miliardi di Daltons (>4000 Kbp). E’ una doppia elica fatta da due sequenze complementari di basi puriniche e pirimidiniche tenute insieme da legami idrogeno (G-C) (T-A). Struttura circolare (lunghezza ~ 1mm)

Mutazioni Mutazione: modifica permanente della sequenza nucleotidica di un gene. Gli alleli sono diverse forme di un gene mutato. Mutageni Agenti chimici e fisici che aumentano la frequenza di mutazione. Fisici: radiazioni, UV, calore Chimici: diretta reazione col DNA, composti nitrosi, agenti alchilanti, analoghi delle basi e composti che richiedono l’attivazione di enzimi cellulari. Mutazioni indotte: molti agenti chimici causano mutazione perché aumentano gli errori di appaiamento tra le due catene di DNA. Altri composti si intercalano tra le eliche (acridine), creano distacchi e complementazioni intracatenarie.

Mutazioni Riparazione dei danni: sistema senza errori (error-free) e sistema con errori (error-prone). Una lesione sul DNA scatena nella cellula la produzione di enzimi deputati alla riparazione (sistema SOS). Gli errori sono rimossi da nucleasi e la catena è riformata sulla base di quella complementare ancora intatta (template). Se anche l’altra catena è danneggiata allora il sistema ripara ma causa errori. Sequenze non senso (UAG, UAA e UGA) sono il segnale di fine traduzione del mRNA, quando per mutazione si crea un non senso la traduzione si interrompe in quel punto.

RICOMBINAZIONE DEL DNA Due tipi di ricombinazione Generalizzata (mediata dal gene recA) Specializzata (recA-indipendente)

TRASFERIMENTO DI MATERIALE GENETICO NEI BATTERI CONIUGAZIONE mediata da F o altri plasmidi coniugativi sexduzione TRASDUZIONE generalizzata o specializzata TRASFORMAZIONE

CONIUGAZIONE Scambio di materiale genetico mediante contatto tra due cellule DONATORE > RICEVENTE Plasmide F Apparato coniugativo per trasferire se stesso – spesso ad alta frequenza Il plasmide F può integrarsi sul cromosoma >> Hfr High frequency of recombination

CONIUGAZIONE F codifica per un pilo sessuale che identifica un recettore (ompA) sulla superficie esterna del ricevente molti plasmidi codificano per un repressore che blocca la formazione del pilo (espresso temporaneamente) dopo contatto con il ricevente il pilo si ritrae e le due cellule sono in comunicazione per via di un ponte citoplasmatico

TRASFERIMENTO DI DNA PLASMIDICO PER CONIUGAZIONE Cromosoma plasmide batterico F Pilo Cellula F- Nella cellula ricevente comincia la sintesi dell’elica complementare Cellula F+ Il Pilo si ritrae -descritta da Lederberg a Tatum nel 1946 -trasferimento di DNA da cellula donatrice (plasmide coniugativo) a cellula ricevente per mezzo del pilo sessuale -Ceppi Hfr  mappatura cromosoma di E.coli Coppia di cellule stabilizzata Il plasmide F è tagliato su un’elica Compimento del trasferimentodel DNA e sintesi le cellule si separano Trasferimento di un’elica di DNA di F da una cellula F+ a una F-. Il plasmide F si replica simultaneamente nelle cellule F+ Cellula F+ F+

CONIUGAZIONE I geni sono trasferiti in ordine fisso Esiste un gradiente di trasmissione Hfr diversi hanno origine diversa Attraverso le frequenze di ricombinazione circolarità del cromosoma Distanze dei geni sul cromosoma (tempo)

CONIUGAZIONE F’ Originano da F che nel distacco dal cromosoma catturano segmenti di DNA può replicarsi autonomamente può ricombinarsi nel ricevente può integrarsi sul cromosoma

CONIUGAZIONE Gram-positivi il donatore forma una proteina sulla superficie della cellula (adesina) che media l’aggregazione con le cellule riceventi le riceventi liberano nell’ambiente dei peptidi (PM 1000) che stimolano la produzione di adesina fusione di protoplasti naturale o mediante glicole etilenico

Trasduzione E' un meccanismo di scambio di materiale genetico mediato da batteriofagi I virus batterici o batteriofagi sono classificati in tre grossi gruppi: Virulenti autonomi: infettano le cellule batteriche e si sviluppano senza richiedere alcuna funzione cellulare (vi sono fagi che al semplice assorbimento con la cellula la uccidono). Virulenti dipendenti: per il loro sviluppo necessitano di funzioni cellulari e quindi la cellula non muore sino a che il virus non giunge a maturazione Temperati: sono virus che solo occasionalmente uccidono la cellula spesso entrano in simbiosi con essa come fanno alcuni plasmidi duplicandosi insieme alla cellula.

The T4 infectious cycle

Lysogeny Temperate phages can convert host to lysogen Establishment likely with high level of infection of bacterial culture, starvation Stable association of phage DNA with bacterial cell (prophage) Normal growth and division of lysogen Environmental cues may induce lytic cycle

TRASDUZIONE generalizzata Cellula batterica Ciclo litico Fago Cellula trasdotta Fago Nelle particelle fagiche vengono incorporati frammenti di DNA, che sono poi trasferiti nelle cellule infettate nel cui genoma si integrano t.specializzata: trasferimento di geni specifici adiacenti al sito di integrazione  t.generalizzata: incorporazione accidentale di DNA della cellula ospite nel capside, il DNA incapsidato al posto di quello fagico viene iniettato in una nuova cellula ospite, dove può ricombinarsi con il DNA omologo Particella trasducente (DNA dell’ospite dentro l’involucro virale) Particella trasducente Cellula batterica Trasduzione Ricombinazione genetica con il DNA dell’ospite

TRASDUZIONE specializzata gal bio gal bio

TRASFORMAZIONE Tre meccanismi distinti Pneumococchi legano DNA doppia elica non specifico entra un solo filamento Haemophilus DNA doppia elica specifico artificiale sferoplasti elettroporazione

TRASFORMAZIONE DNA trasformante Nucleotidi liberi Cromosoma batterico Proteina di legame al DNA Proteina specifica della competenza che lega il DNA a singola elica Nucleasi Nucleotidi liberi Scoperta da Griffith nel 1928 -incorporazione di DNA esogeno (fissazione alla cellula competente, penetrazione, eclisse, integrazione) -specie naturalmente competenti: S.pneumoniae, H.influenzae, Bacillus spp., Neisseria spp. -La competenza si sviluppa verso la fine della fase logaritmica (N.meningitidis inizio) Proteina RecA

TRANSPOSIZIONE Sequenza bersaglio Elemento transponibile inserito Sequenza bersaglio duplicata

Specificità d’ospite del DNA (Enzimi di restrizione modificazione del DNA) Il materiale genetico (DNA) sintetizzato dai batteri subisce un processo di metilazione che è specifico di ogni specie batterica La modificazione del DNA è come un’ identità del materiale genetico che è riconosciuto da enzimi (nucleasi) detti di restrizione, in quanto degradano ogni DNA che è stato prodotto in altre specie batteriche (estraneo)

Specificità d’ospite del DNA (Enzimi di restrizione modificazione del DNA) Ogni volta che una cellula batterica riceve DNA da altre specie questo è riconosciuto come estraneo e quindi degradato L’efficienza di questo meccanismo varia da specie a specie (0- 1x10-4) Gli enzimi di restrizioni sono utilizzati in Biologia Molecolare (ingegneria genetica, mappe di restrizione ecc)