Esperienza di polarimetria Dott. Alfonso Zoleo Laboratorio di Metodologie Spettroscopiche per le Biotecnologie AA 2014-2015

Concetti fondamentali La luce possiede una proprietà chiamata polarizzazione. La polarizzazione descrive la direzione di oscillazione del campo elettrico dell'onda. Si dice che la luce è polarizzata linearmente se il campo elettrico oscilla sempre su un piano. In figura è mostrata un'onda polarizzata linearmente: il campo elettrico oscilla sempre sul piano xy (e il campo magnetico sempre sul piano xz) E x y z Piano xy B Se guardo un’onda polarizzata linearmente che viene verso di me, il campo elettrico lo “vedo” oscillare così

Concetti fondamentali Si dice che la luce è polarizzata circolarmente se il campo elettrico ruota intorno alla direzione di propagazione. La rotazione ha luogo alla frequenza propria dell’onda. Il modulo del campo elettrico è costante. Se guardo un’onda polarizzata circolarmente che viene verso di me, il campo elettrico lo “vedo” ruotare La luce prodotta da una lampada (o la luce solare) è non polarizzata (il campo elettrico oscilla casualmente in ogni direzione).

Concetti fondamentali Dobbiamo inoltre considerare che il campo elettrico è un vettore, e quindi esso può essere sempre rappresentato ugualmente bene come somma delle sue componenti lungo direzioni prefissate: In questo esempio ho scomposto il vettore campo elettrico dell’onda, posto in una direzione qualsiasi (perpendicolare alla direzione di propagazione x), in due vettori diretti lungo y e lungo z. Sussiste la relazione: y z x E(t) Ey(t) Ez(t) = versore diretto lungo y = versore diretto lungo z

Concetti fondamentali Il polarizzatore è un dispositivo che lascia passare solo la componente del campo elettrico della luce che è diretta secondo un asse (detto di polarizzazione) polarizzatore direzione di propagazione della luce Luce non polarizzata Luce polarizzata linearmente lente lampada

Concetti fondamentali Quando un fascio di luce polarizzata linearmente, con il campo elettrico inclinato rispetto all’asse polarizzatore, incide sul polarizzatore, la componente del campo perpendicolare all’asse viene bloccata: rimane solo la componente lungo l’asse. I= intensità della luce. E’ proporzionale al quadrato del campo elettrico della radiazione Asse del polarizzatore E E cos(q) E sen(q) q I0=k E2 I=k E2 cos2(q) Intensità della luce dopo aver attraversato il polarizzatore I=I0 cos2(q) Intensità della luce prima di attraversare il polarizzatore Legge di Malus!!

Importanza dell’attività ottica in biologia Molte sostanze (dette otticamente attive) ruotano di un certo angolo il piano della luce polarizzata linearmente che attraversa una soluzione che le contiene. Praticamente tutte le sostanze di interesse biologico (enzimi, zuccheri, proteine) sono otticamente attive Misurare la variazione di attività ottica di una sostanza biologica è un modo per studiare reazioni e cambiamenti di quella sostanza

Potere ottico rotatorio (POR) di una sostanza Definizione L'angolo di rotazione α del piano della luce polarizzata (in gradi) diviso per la lunghezza di cammino ottico attraverso il mezzo (b, in dm), diviso a sua volta o per la concentrazione in massa (c, in g/ml) della sostanza (potere ottico rotatorio specifico [a]λq ) o per la concentrazione molare (potere ottico rotatorio molare [am]λq ) . Il POR specifico (o molare) di una sostanza dipende dalla lunghezza d’onda della luce polarizzata e dalla temperatura. Convenzionalmente si usa luce gialla monocromatica a 589 nm (riga D del sodio), e la misura è effettuata a 20°C

Molecole otticamente attive Sperimentalmente si osserva che tutte le soluzioni di composti enantiopuri ruotano il piano della luce polarizzata. D-alanina L-alanina Enantiomero S Enantiomero L Enantiopuro = composto che contiene solo un tipo di enantiomero Enantiomero = uno dei due stereoisomeri di una molecola che sono immagini speculari non sovrapponibili l’uno dell’altro Tutti gli aminoacidi biologici (tranne la glicina) sono chirali, ovvero solo una delle forme è usata biologicamente Carbonio chirale

Gli Zuccheri Consideriamo un esempio * sono centri chirali enantiomeri

In soluzione il D-glucosio forma due diastereoisomeri I monosaccaridi (aldosi) semplici sono soggetti alla formazione di semiacetali In soluzione il D-glucosio forma due diastereoisomeri Quando una delle due forme viene sciolta in acqua, lentamente si ottiene un equilibrio delle due forme con il 36% della forma α e il 64% della forma β. Il P.O.R. misurato cambia quindi con il tempo (Mutarotazione), fino al raggiungimento dell'equilibrio. La soluzione deve essere quindi lasciata equilibrare prima di effettuare la misura.

D-(+)-galattosio 82 D-(+)-glucosio (destrosio) 52.7 D-(-)-fruttosio (D-Levulose) -89.5 Saccarosio (glucosio-fruttosio) 66.5 Saccarosio invertito (glucosio e fruttosio) -20 (25 C) Maltosio (dimero del glucosio) 138.5

L’ESPERIENZA: MISURA DEL POTERE OTTICO ROTATORIO DI SACCARIDI Il principio della misura è molto semplice: Si prepara una soluzione dello zucchero di interesse a concentrazione nota Si riempie con acqua o con la soluzione un tubo polarimetrico Si predispone una fascio di luce polarizzata e lo si fa attraversare il tubo Si trovano la orientazione della luce polarizzata in uscita quando nel tubo c'è l'acqua e quando c'è la soluzione Dalla distanza angolare fra le due posizioni del polarizzatore analizzatore si calcola il potere ottico rotatorio Vediamo la realizzazione pratica

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA PRIMO GIORNO: Preparazione delle tre soluzioni del saccaride a concentrazione nota. Le tre soluzioni devono avere una concentrazione compresa tra 0,05 g/ml e 0,3 g/ml La preparazione viene effettuata in matracci da 50 ml Le tre soluzioni devono essere lasciate termostatare a 25°C per 24 h (equilibrio anomerico)

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA PRIMO GIORNO/SECONDO GIORNO: Costruzione del polarimetro 6) Tubo polarimetrico 8)Fotodiodo 4) Polarizzatore 6) Analizzatore Componenti del polarimetro 1) Sorgente luminosa (LED o laserino) 7) Lente collimatrice del fascio 2) Lente collimatrice del fascio 3) Chopper

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA PRIMO GIORNO/SECONDO GIORNO: Costruzione del polarimetro 1) Mettere per prima la lampada (il LED) sulla rotaia 2) Piazzare sulla rotaia, davanta alla lampada, la lente collimatrice, avendo cura che il centro del LED sia allineato con il centro della lente (regolando altezza e posizione della lente) 3) Spostare la lente lungo la rotaia fino a che il fascio appare allineato: verificarlo usando un foglio e vedendo se lo spot luminoso dopo la lente non cambia variando la distanza del foglio 50 cm 4) Piazzare la lente focalizzante a 50 cm dall’altra lente 5) Piazzare il fotodiodo nel fuoco della lente

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA PRIMO GIORNO/SECONDO GIORNO: Costruzione del polarimetro 6) Aggiungere il CHOPPER: il chopper è un disco con dei fori che ruota azionato da un motorino elettrico. Variando la tensione dell’alimentatore del motorino è possibile cambiare la frequenza di rotazione del disco. In questo modo è possibile trasformare la luce continua in luce pulsata 7) Aggiungere il polarizzatore, il tubo polarimetrico e l’analizzatore

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA PRIMO GIORNO/SECONDO GIORNO: Costruzione del polarimetro 8) Collegare l’oscilloscopio: il trigger dal chopper e il segnale in uscita dal fotodiodo in ingresso

Perché usare il CHOPPER ? Per avere luce pulsata. In questo modo sull’oscilloscopio si potra avere un segnale on (quando la luce colpisce il fotodiodo) e off (quando il chopper blocca la luce). La differenza delle due tracce è direttamente proporzionale all’intensità della luce che colpisce il fotodiodo. Nota bene: l’oscilloscopio lavora solo con segnali nel tempo! La sottrazione luce on-luce off consente di eliminare la luce ambientale!! Chopper Fotodiodo Luce Luce on Intensità della luce Luce off Trigger dal chopper Ext Ch1 Ch2

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA SECONDO GIORNO: Esecuzione della misura 1) Inserire l’acqua nel tubo polarimetrico. Mettere il tubo fra i polarizzatori Analizzatore 2) Ruotare l’analizzatore finché il segnale sull’oscilloscopio scompare

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA SECONDO GIORNO: Esecuzione della misura 3) Ruotare in senso inverso (antiorario in figura) di 20° l’analizzatore (c’è un goniometro per la lettura dei gradi) 20° Analizzatore 4) Leggere l’intensità della luce (in mV) sull’oscilloscopio e l’angolo leggibile sul goniometro dell’analizzatore in questa posizione

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA SECONDO GIORNO: Esecuzione della misura 5) Ruotare di 4° in senso orario l’analizzatore e prendere nuovamente il valore di intensità (in mV) letto sull’oscilloscopio e l’angolo letto sul goniometro Analizzatore 6) Ripetere il punto 4) per un totale di 10 punti (spazzata di 40°)

TEMPI ED ESECUZIONE DELL’ESPERIENZA SECONDO GIORNO: Esecuzione della misura 7) Svuotare il tubo polarimetrico e riempirlo con la soluzione zuccherina più diluita 8) Ripetere la misura per la soluzione (punti 1-6) 9) Ripetere per le altre due soluzioni in concentrazione crescente (punti 1-8) NOTA BENE: 1) Non cambiare configurazione ai polarizzatori nel passaggio da una soluzione ad un’altra 2) Quando si passa da una soluzione all’altra, l’angolo di minimo (cioè quando non si vede più segnale sull’oscilloscopio) va cercato in prossimità del minimo precedente.

Parti dello strumento Tubo polarimetrico Polarizzatori Lenti Rotaia e supporti Rivelatore Sorgente a 589 nm

ELABORAZIONE E PRESENTAZIONE DEI DATI Al termine del secondo giorno di lavoro, ogni gruppo avrà a disposizione i seguenti set di dati: Un gruppo di 10 punti (mV, angolo) acquisiti ogni 4° nell’intorno del minimo per l’acqua pura Tre gruppi di 10 punti (mV, angolo), acquisiti ogni 4°, nell’intorno del minimo: un gruppo per ognuna delle tre soluzioni di zucchero

ELABORAZIONE E PRESENTAZIONE DEI DATI I punti acquisiti ogni 4° , relativi all’acqua pura e alle soluzioni zuccherine, vengono messi in grafico con il software Origin. Poiché i punti sono presi in una zona limitata attorno al punto di minimo, si assume che possano seguire una parabola. I punti vengono fittati in modo non-lineare usando l’equazione parabolica nella forma ax2+bx+c Il punto di minimo della parabola è dato da x0=-b/(2a)

a=x0(sol)-x0(acq) a=b c [a] ELABORAZIONE E PRESENTAZIONE DEI DATI Dalla differenza fra la distanza angolare di minimo x0 di ogni soluzione con la distanza agolare di minimo dell’acqua si calcola il potere ottico rotatorio di ogni soluzione: a=x0(sol)-x0(acq) Riportando in grafico il POR di ogni soluzione contro la concentrazione, e facendo un fitting lineare pesato con Origin, si ricava il POR specifico (o molare, a scelta degli studenti): a=b c [a]

Relazione Ogni gruppo deve presentare una relazione sulla polarimetria La relazione deve essere essenziale: Max. una paginetta (= una facciata) di introduzione con le basi e l’obiettivo del lavoro Max 4 pagine di parte sperimentale

Turni e gruppi Gruppi Mer 5/11/2014 Gio 6/11/2014 Ven 7/11/2014 UV Pol/UV Pol Elab Rec 2 3 4 5 6

Organizzazione Mercoledì 5/11 14:00-15:00 spiegazione pratica UV-VIS e fluorescenza + preparazione delle soluzioni zuccherine 15.00-18.00: Gruppi 1-3 esecuzione UV-VIS, gruppi 4-6 preparazione soluzioni e montaggio del polarimetro Giovedì 6/11 14:00-18:00: gruppi 1-3 preparazione soluzioni zuccherine + elaborazione UV-VIS; gruppi 4-6 misure polarimetriche Venerdì 7/11 14:00-18:00: gruppi 1-3 montaggio polarimetro e misure polarimetriche; guppi 4-6 UV-VIS Mercoledì 19/11 14:00-18:00: Elaborazione/Recupero