Oncologia Sperimentale di laboratorio METASTASI SPERIMENTALI RIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO IN VITRO 5° S. Beninati

METASTASI SPERIMENTALE Il processo metastatico può essere riprodotto sperimentalmente e quindi suddiviso nelle fasi che lo compongono. In tal modo è possibile studiare i diversi momenti dell’invasione metastatica riducendo le possibili variabili. L’osservazione diviene facilmente interpretabile, permettendo di definire il bersaglio della ricerca

Farmaci antineoplastici Una molecola o un insieme di molecole si definisce antineoplastica quando esercita una azione tesa ad inibire lo sviluppo e la disseminazione delle cellule tumorali. Il termine antineoplastico è generico poiché non specifica quale fase della crescita tumorale viene colpita dalla molecola.

Antiproliferativo o antimetastatico? Un tumore può essere altamente proliferante ma con bassa metastaticità (questa condizione è presente anche nei tumori benigni) Al contrario può essere altamente metastaticio ma con bassa proliferazione Può anche possedere le due caratteristiche assieme

Modelli sperimentali Al fine di studiare quale fase del processo tumorale viene influenzata dalla molecola in esame, si utilizzano modelli sperimentali. Si distinguono come: 1. modelli multivariabile (poiché comprendono più fasi del processo) 2. modelli monovariabile (poiché viene valutata una singola fase del processo)

Camere di Boyden un esempio di modello multivariabile Le camere di Boyden rappresentano un modello sperimentale multivariabile, poichè riproduce i seguenti passaggi: 1. adesione 2. rilascio di metalloproteasi 3.invasione Tale modello quindi permette di valutare il potere metastatico nelle tre variabili citate

ADESIONE Le cellule tumorali aderiscono al substrato (Matrigel) PROTEOLISI Secrezione di matalloproteasi che idrolizzano il Matrigel

INVASIONE Superata la barriera del Matrigel le cellule tumorali invadono il compartimento sottostante

Modelli monovariabile I modelli monovariabile permettono di discriminare i singoli passaggi del processo metastatico. Si effettuano in vitro utilizzando cellule di una linea tumorale metastatica e in vivo utilizzando topi o ratti. Con questi modelli è possibile valutare l’effetto di un farmaco su di una o più fasi del processo metastatico.

Modelli sperimentali in vitro Essi permettono di valutare: proliferazione adesione migrazione Invasione

Modelli sperimentali in vivo Permettono di valutare due parametri: proliferazione Colonizzazione/invasione

Modelli in vitro: Proliferazione La proliferazione cellulare è legata a cinque fasi della vita della cellula: Il ciclo di crescita Il ciclo cellulare La divisione cellulare Il differenziamento Morte cellulare (Apoptosi e/o Anoikis)

Il ciclo di crescita IL CICLO DI CRESCITA CONTROLLA MOLTI PASSAGGI CHE SONO NECESSARI PER LA COLTURA DI CELLULE ANIMALI. LA DENSITÀ CELLULARE DI SEMINA IL TEMPO DI CRESCITA LA DURATA DI UN ESPERIMENTO IL MOMENTO ADATTO PER IL PRELIEVO DEI CAMPIONI IL METABOLISMO CELLULARE

Il ciclo cellulare

La divisione cellulare

* Proliferazione cellulare in presenza di farmaci antineoplastici % proliferation Time (hrs) * Proliferazione cellulare in presenza di farmaci antineoplastici

Il differenziamento Nelle linee cellulari utilizzate, il differenziamento può essere rivelato osservando alcuni markers specifici. Nelle linee di melanoma l’aumentata produzione di melanina è segno di differenziamento

µg melanin/mg protein Control AE 48h AE 72h Linea cellulare B16-F10

Morte cellulare (Apoptosi) il termine apoptosi indica una forma di morte cellulare programmata. Si tratta di un processo ben distinto rispetto alla necrosi cellulare, e in condizioni normali contribuisce al mantenimento del numero di cellule di un sistema.

Una cellula in apoptosi Una cellula in apoptosi. In uno dei molti scenari apoptotici, il processo è stimolato da una cellula adiacente; la cellula morente espone in seguito segnali che richiamano dei macrofagi

Percentuale di cellule in apoptosi misurata con il citofluorimetro (evidenzia il numero di cellule in una certa fase del ciclo cellulare)

Cellule apoptotiche

Cellule in apoptosi

Cellule in apoptosi

Morte cellulare (Anoikis) Anoikis rappresenta l’apoptosi indotta da uno scorretto attacco delle cellule alla matrice extracellulare (ECM). E’ il meccanismo attraverso il quale le cellule in vivo utilizzano segnali che derivano dal ECM per mantenere l’integrità dei tessuti. Leggere: Gilmore A.P. Cell Death and Differentiation (2005)12,1473

Modelli in vitro:adesione Il primo passo per lo stravaso delle cellule tumorali è l’adesione alle cellule endoteliali, mediato da molecole di adesione cellulare (cell adhesion molecules – CAMs), che comprendono la famiglia I-CAM ed N-CAM (integrine), lectine di superficie cellulare e glicoproteine che si legano alle lectine espresse dalle cellule. Un ruolo fondamentale in questa fase del processo metastatico è svolto dalle piastrine e dalle selettine E e P degli endoteliociti. le cellule neoplastiche, per potere ancorarsi stabilmente agli endoteliociti, devono essere fornite di ligandi per le selettine E e P e devono possedere proprie selettine che riconoscano ligandi consensuali espressi dagli endoteliociti.

Adesione cellulare Le molecole responsabili dell’adesione cellulare (CAM = Cell Adhesion Molecules) sono un particolare tipo di recettori glicoproteici che prende parte attiva nella costituzione delle strutture adesive della superficie cellulare. Ci sono diverse famiglie di CAM; tutte sono costituite da glicoproteine integrali che si estendono nella membrana plasmatica, con domini che protrudono da entrambi i versanti della membrana stessa. Le CAM che si legano possono essere dello stesso tipo (legame omotipico) o di tipi diversi (legame eterotipico). Una delle principali famiglie CAM, le Ig-CAM, è composta da molecole con domini di superficie correlati agli anticorpi. Tra più delle 30 Ig-CAM esistenti si annoverano le C-CAM, trovate sulla superficie delle cellule epatiche, le N-CAM, le molecole di adesione neuronale, e le Ng-CAM, le molecole di adesione neuro-gliali. La I-CAM, invece, si trova su svariati tipi cellulari, tra cui i leucociti. Tutte le Ig-CAM possono instaurare legami omo- ed eterotipici. Un’altra famiglia di CAM, le caderine, possono instaurare solo legami omotipici. Tutti i membri di questa famiglia sono Ca++-dipendenti Tra i membri di questa famiglia ci sono le L-CAM, trovate su cellule epatiche e altri tipi cellulari, e le P-caderine, trovate sulle cellule della placenta e su quelle epiteliali. La famiglia LEC-CAM si trova sui leucociti e su altre cellule del sistema circolatorio.

Adesione e sedi vascolari La selettività per specifiche sedi vascolari è legata ai meccanismi di adesione alle pareti vasali. Ma anche al tipo di enzimi degradativi prodotti dalla cellula neoplastica e di enzimi inibitori presenti nel tessuto invaso Contribuiscono anche fattori chemiotattici e aptotattici che guidano l’insediamento della singola cellula nei siti ottimali per la proliferazione, ai fattori di crescita autocrini e paracrini e alla possibilità di iniziare e mantenere il processo angiogenico.

Test di adesione cellulare in vitro Si utilizzano piastre da 96 pozzetti il cui fondo è rivestito con collagene, laminina o fibronectina. Le cellule da saggiare vengono piastrate nei pozzetti e incubate per 2 ore a 37 C°. Dopo aver rimosso il mezzo di coltura si aggiunge un colorante vitale e quindi incubate per altri 10 minuti a temperatura ambiente.

PROTOCOLLO I pozzetti vengono quindi lavati tre volte con un tampone isoosmotico. Infine i pozzetti sono lavati con acqua distillata e le piastre lette con un lettore automatico alla lunghezza d’onda del colorante aggiunto. In tal modo sono valutate le cellule adese al fondo dei pozzetti

Adhesion (Matrigel adhesion assay) N° adherent cells Adhesion (Matrigel adhesion assay) 33

Modelli in vitro:migrazione Il monostrato cellulare quando danneggiato, risponde alla distruzione del contatto cellula-cellula e alla produzione di fattori di crescita nel punto danneggiato, cercando di rimarginare la ferita per mezzo sia della proliferazione che della migrazione. Questi processi riflettono il compartamento di ogni singola cellula, ma anche quello di tutta la popolazione cellulare. Il tipico “Wound Healing assay”, (WHM) si ottiene graffiando la superfice di una coltura cellulare ala confluenza, usando l’ago di una siringa o la punta di una pipetta. Il monostrato cellulare cerca di sanare la ferita in tempi relativamente brevi (da 3 a 48 ore). Il processo può essere quantificato con l’analisi di immagine computerizzata sotto osservazione al MO

(Wound Healing Migration Assay) CONTROLLO TEMPO 0 48 ORE Migration (Wound Healing Migration Assay) * 36

(Wound Healing Migration Assay) C ontrol AE * 37

circular wound-healing (CWA) Una variazione del “Wound Healing Migration Assay” è il CWA. In questo caso si utilizza una punta di silicone ruotante per creare una ferita circolare uniforme, in un momolayer di cellule alla confluenza.

circular wound-healing (CWA)

Modelli in vitro: invasione L’invasione di cellule tumorali può essere valutata con il “3D invasion/morphogenic assay” oppure con il “Circular invasion assay”. Nel 3D invasion/morphogenic assay le cellule sono immerse in una matrice gelatinosa che mima la matrice extracellulare. Il modello si definisce tridimensionale poiche le cellule possono migrare nelle tre dimensioni dello spazio. Al fine di valutare la capacità invasiva vengono contate le estroflessioni cellulari dopo un certo periodo di tempo

(3D invasion/morphogenic assay) Control 72h 48h (3D invasion/morphogenic assay) 42

(3D invasion/morphogenic assay) N° of processes / cell Control AE 48h AE 72h (3D invasion/morphogenic assay) 43

Circular invasion assay (CIA) Il “circular invasion assay” (CIA) si è sviluppato recentemente (2007) per sostituire il classico in vitro “wound-healing assays” e altre tecniche per lo studio della migrazione e invasione nelle metastasi.

Circular invasion assay Anche in questo caso si utilizza una punta ruotante di silicone che crea una ferita perfettamente circolare nel monolayer cellulare. A differenza del CWA la tecnica CIA utilizza il Matrigel che viene steso sopra la coltura cellulare, mimando la matrice extracellulare. Il modello si avvicina molto a quello che accade in vivo l’aggiunta di Matrigel permette di valutare la reale invasione. A differenza del CWA che permette di valutare solamente la migrazione. Comparando le dimensioni della ferita nel tempo si può quantificare l’invasione di cellule tumorali

Circular invasion assay t=0 AE Control % wound closure Control AE * 10 20 30 12h 24h Circular invasion assay 46