Lezione mercoledì 13 Marzo 2011 corso vettori biologici II Biotec industriali ore 14:00 -16:00 aula 6A

Colli di bottiglia limitanti Strategie di clonaggio per una buona efficienza a monte della trasfezione: - siti di restrizione adottati (es. BamHI) per libraries o per clonaggio di singoli frammenti, - rapporti quantitativi inserto/plasmide o inserto/vettore

La struttura del vettore dal punto di vista genomico non è diverso dagli altri vettori per la struttura delle parti che devono specificare la sua funzione nella cellula ospite. la differenza sta nel capside con cui viene veicolato per ottenere alta efficienza di trasfezione “pseudo-infezione” molti vettori che vengono trasfettati con metodologie chimiche o fisiche hanno delle parti che possono derivare da virus o fagi e però non essere impacchettati o prodotti come particelle virali, viceversa alcuni vettori possono essere impacchettati in particelle virali senza contenere gran parte del genoma virale, mediante helper-virus vettori virali analizzati a parte

Uso di vettori virali L’uso di vettori virali è considerato valido non solo per la facilità di trasfezione - infezione (passaggio dalla membrana), ma anche per l’uso di strutture genomiche utili per la replicazione del virus, l’integrazione del virus, l’attivazione di geni tramite promotori virali, strutture come IRES e molte altre utilizzate per ingegnerizzare i vettori

I limiti dei vettori virali Nell’uso per trasfettare linee cellulari alcuni limiti sono dati dalla difficoltà: - di fare virus incompleti che non possano ricombinare per ridare virulenza, - di avere solo le funzioni per la sintesi del capside, - di impedire la ricombinazione con virus helper per ridare virus completi riarrangiati Nel caso di uso su animali in vivo i problemi possono essere: - antigenicità dei virus, quindi l’impossibilità del riutilizzo per più dosi o ripetizione della infezione - ricombinazione con virus endogeni e rivirulentizzazione

Strutture dei vettori La struttura dei vettori deriva dall’assemblaggio di parti note per varie funzioni con alta efficienza per lo scopo preposto. - espressione integrazione o transiente : promotore forte, costitutivo, polyA, IRES (internal ribosome entry site), gene reporter, - solo per integrazione: promotore inducibile, repressore disattivabile inducibile, enzima per resistenza ad antibiotico, strutture a cassetta per siti specifici di ricombinazione,

Vettori per integrazione nel genoma sono fatti per prevedere integrazione secondo il meccanismo scelto a livello di organismi o cellule - ci possono essere enzimi che attivano la ricombinazione su siti spefici, sistema cre-lox o Frt FLP -ricombinazione sito specifica solo per omologia di sequenza con la regione endogena in cui si vuole fare ricombinare il vettore, l’evento ha una frequenza 1/ per trovare i ricombinanti si seleziona per un antibiotico

Per preparare il vettore Metodi per assemblare il vettore Con enzimi di restrizione classici del clonaggio Con prodotti di PCR con assemblaggio per complementarietà

clonare e controllare quando si clona come si può essere sicuri di aver clonato la cosa giusta ? cosa sono i controlli e come si fanno? Si deve saggiare l’ipotesi opposta (esclusione/inclusione) negare che non sia stato il caso a dare l’evento la selezione con l’antibiotico garantisce che sia presente il plasmide ci deve essere anche l’inserto!

controllo dell’inserto clonato 1° controllo per grandi frammenti = Southern 2° corsa elettroforetica della miniprep batterica del DNA plasmidico superavvolto o linearizzato o separando inserto da vettore con enzimi esterni al sito di clonaggio ma interni al sito multiplo di clonaggio SMC o MCS 3°controllo per PCR (vedremo prossimamente) con strategie diverse tramite primers scelti sul plasmide ed eventualmente sul DNA clonato quando è lungo con successiva analisi su gel di agarosio 4° controllo: sequenziamento diretto dei punti critici del clonaggio (conservazione della open-reading-frame) oppure il verso di inserzione dell’inserto clonato

Piastra clonaggio E coli lac-z

Replica plate

Crescita di batteriofagi

Placche di fagi

VETTOREOSPITETIPO DI CLONAGGIO GRANDEZZA INSERTO Plasmidebatteri, lievitigenomico, cDNA fino a 15kb Batteriofagobatterigenomico, cDNA fino a 20 kb Cosmidibatterigenomicofino a 45 kb BACsbatterigenomicoda 100 a 300 kb YACsLievitigenomicoda 100 a 2000kb Tipi di vettori di clonaggio

genomi

dal genoma alla cDNA library

dal DNA al fenotipo

la doppia elica da e riceve informazioni l’informazione genetica non procede a senso unico dal genoma verso il nucleo - citoplasma - matrice - e ambiente, è vero anche il contrario perchè il genoma deve essere pronto a ricevere messaggi dall’ambiente in cui si trova le cellula: questa è la regolazione