Emoglobina (Hb) Costituisce il 90% delle proteine del globulo rosso (ca. 300 milioni di molecole per cellula) E’ un trasportare di O2: si lega a questo elemento quando si trova nei polmoni (o nelle lacune di Wolff del sacco vitellino o nella placenta) o lo rilascia nei tessuti Grazie all’Hb il sangue è in grado di trasportare una quantità di O2 100 volte più elevata di quella che potrebbe essere trasportata da un ugual volume di soluzione salina acquosa come il plasma  l’Hb rende il sangue capace di trasportare MOLTO O2

proteina tetramerica composta da una parte proteica ed una non proteica Gruppo eme: l’atomo di Fe è in grado di legare l’O2 solo quando si trova allo stato ridotto (Fe2+) La parte proteica crea il microambiente idrofobico necessario a mantenere l’atomo di Fe nel suo stato ridotto

Curva di dissociazione dell’Hb e sua dipendenza dal pH La curva di dissociazione e la sua dipendenza dal pH e dalla concentrazioni di alcuni composti chimici dipendono dalla parte proteica

Nei diversi periodi dello sviluppo l’approvvigionamento di O2 avviene in strutture diverse  necessità di differenti Hb ciascuna espressa in uno specifico periodo ontogenetico e adatta ad associarsi all’O2 nella specifica struttura di approvvigionamento La parte proteica è sempre costituita da 4 catene polipeptidiche uguali due a due (2 catene di tipo a e 2 catene di tipo non-a) Emoglobine embrionali Hb Gower I (z2e2) Hb Portland (z2g2) Hb Gower II (a2e2) emoglobina fetale Hb F (a2g2) Emoglobine adulte Hb A2 (a2d2) Hb A (a2b2)

Produzione dei vari tipi di catene globiniche nelle diverse fasi della vita di un individuo I due switch (embrionale  fetale e fetale  post-natale) sono controllati a livello trascrizionale

Produzione di eritrociti Qual è l’origine delle cellule F ? Negli adulti è presente una certa quota di HbF a distribuzione non uniforme: si trova in poche cellule  cellule F La quantità di HbF aumenta in condizioni di stress emopoietico (es. in carenza di O2) Qual è l’origine delle cellule F ? Due ipotesi: 1) due popolazioni diverse di cellule staminali 2) un’unica popolazione in grado di attuare due diversi programmi trascrizionali Risposta: un’unica popolazione di cellule staminali  Cloni originatesi da una singola cellula progenitrice contengono sia cellule con HbF che cellule con HbA

Produzione di tutti gli elementi figurati del sangue

L’eritropoiesi ricapitola l’ontogenesi Lo switch feto adulto è dovuto a uno switch del programma trascrizionale delle cellule progenitrici e non ad uno switch nell’attivazione di popolazioni staminali diverse L’eritropoiesi ricapitola l’ontogenesi Stamatoyannopoulos G (2005) – Exp Hematol 33: 259

le catene di tipo a sono lunghe 141 aminoacidi, i loro geni si trovano sul cromosoma 16 (cluster a, circa 30 kb) le catene di tipo b sono lunghe 146 aminoacidi, i loro geni si trovano sul cromosoma 11 (cluster b, ca. 60 kb) catene di tipo a e di tipo b mostrano una forte omologia di sequenza ad indicare una loro origine evolutiva comune Una notevole omologia si riscontra anche con la sequenza della mioglobina  proteina che lega l’O2 nel muscolo

Mioglobina Emoglobina

I geni globinici sono di piccole dimensione (< 1 I geni globinici sono di piccole dimensione (< 1.6 kb) hanno 3 esoni e 2 introni, il 38% della loro sequenza è codificante In entrambi i cluster i geni sono organizzati secondo l’ordine temporale in cui sono espressi e sono presenti delle regioni regolative (LCR = Locus Control Region), poste diverse kb a monte dei geni stessi, che sono necessarie per l’espressione di tutti i geni del cluster

I due cluster dei geni globinici

Organizzazione dei due cluster globinici: cluster a (cromosoma 16) e cluster b (cromosoma 11 Strachan e Read – Genetica Molecolare Umana, Zanichelli, 2012

Lo studio delle Hb e dei loro geni ha portato contributi fondamentali in vari campi della biologia La proteina si trova in forma praticamente pura all’interno dei gl.rossi  cellule di un tessuto facilmente accessibile Molti individui hanno patologie, anche di tipo quantitativo, dovute a mutazioni dei geni globinici o delle regioni di controllo  talassemie, HPFH

n° catene a/n° catene non-a = 1 In ogni momento della vita di un individuo (periodo embrionale, fetale e post-natale) il rapporto n° catene a/n° catene non-a = 1 Si definisce talassemia la condizione in cui tale rapporto  1 alfa talassemie  a/non-a < 1 (c’è un difetto di catene a) beta talassemie  a/non-a > 1 (c’è un difetto di catene non a, che nell’adulto sono sostanzialmente le b) Le talassemie sono quindi un difetto QUANTITATIVO generalmente dovuto a perdita di funzione

Nomenclatura Microcitemia o Talassemia minor o Trait talassemico  sono sinonimi e indicano la condizione CLINICAMENTE ASINTOMATICA degli eterozigoti facilmente individuabili attraverso un semplice esame ematologico Anemia mediterranea o Morbo di Cooley o Talassemia major  sono sinonimi e indicano il quadro clinico, molto grave (mortale in assenza di cure) degli individui omozigoti (o eterozigoti composti per alleli non funzionanti) Si definiscono alleli bthal0 (athal0) gli alleli che causano assenza completa di catene b (a) alleli bthal+ (athal+) causano una riduzione più o meno marcata di catene b (a)

gli eritrociti sono però più piccoli I principali parametri del sangue che risultano alterati nei microcitemici g/dl g/dl per ml per ml m3 m3 nei microcitemici la quantità totale di Hb è ridotta mentre il numero di globuli rossi è aumentato gli eritrociti sono però più piccoli il ridotto contenuto di Hb determina un appiattimento delle emazie e una loro maggiore resistenza all’emolisi in soluzione salina ipotonica.

in soluzione ipotonica l’emolisi delle emazie normali è totale e il liquido color rosa è limpido; le emazie microcitemiche vengono distrutte solo in parte e la soluzione resta torbida.

NORMALE MICROCITEMICO

i globuli rossi dei malati sono quasi completamente privi di Hb, sono molto pochi e presentano marcate alterazioni morfologiche, alcuni sono solo dei frammenti, tutti vanno incontro ad una precoce distruzione

EPATO- E SPLENOMEGALIA NEI MALATI NON CURATI SI OSSERVANO GRAVISSIME DEFORMAZIONI DEL CRANIO E DELLA FACCIA, OLTRE A EPATO- E SPLENOMEGALIA

FREQUENZA DELLA MICROCITEMIA NEL MONDO La microcitemia è frequente in tutti i paesi che si affacciano sul Mediterraneo (da cui il nome di anemia mediterranea) e in tutto il sud-est asiatico si calcola che i portatori sani nel mondo siano circa 180.000.000 e, in assenza di prevenzione, le nascite di nuovi malati 70.000 ogni anno

FREQUENZA DELLE MICROCITEMIE IN ITALIA in Italia vivono circa 2.500.000 microcitemici sani grazie alla prevenzione le nascite di individui malati sono molto limitate la frequenza dei portatori sani è molto alta nelle regioni meridionali, in Sardegna, in Sicilia e nella regione del delta del Po

dal GENE al PRODOTTO POLIPEPTIDICO FUNZIONANTE Il gene deve essere presente; Il gene deve essere trascritto; Il trascritto deve essere maturato: rimozione degli introni, aggiunta del CAP, aggiunta del poli-A L’mRNA maturo deve essere portato nel citoplasma e caricato sui ribosomi; La traduzione deve avere inizio; L’mRNA deve essere tradotto per tutta la sua lunghezza; La catena polipeptidica deve essere stabile e in grado di svolgere la sua funzione

Maturazione del trascritto primario (produzione di mRNA)

Produzione del trascritto primario e rimozione degli introni

Mutazioni che causano ‘perdita di funzione’ EVENTO COMPROMESSO REGIONE GENICA MUTATA TIPO DI ALLELE N° DI ALLELI NOTI CONSEGUENZA FUNZIONALE Trascrizione Promotore Thal (+) 19 L’attività trascrizionale residua varia tra il 20 e il 50% Splicing Introne, sito donatore o accettore Introne, sequenze consesus Introne, attivazione di un sito criptico Esone, attivazione di un sito criptico Thal (0) 16 6 5 (3 MS e 2 SS) Exon skipping o ritenzione dell’introne (o di parte di esso) mRNA normale presente in quantità ridotta + mRNA anormale Come sopra Come sopra, inoltre in caso di mutazione MS la globina prodotta presenta una SSA

CONSEGUENZA FUNZIONALE EVENTO COMPROMESSO REGIONE GENICA MUTATA TIPO DI ALLELE N° DI ALLELI NOTI CONSEGUENZA FUNZIONALE Taglio dell’RNA e poliadenilazione Sito di adenilaz. AATAAA Thal (+) 6 RNA normali + RNA instabili Capping Sito del capping 1 Attacco al ribosoma 5’ UTR RBS=Ribos. Binding Site 7 Assenza di traduzione Inizio traduzione 1° codone (AUG) Thal (0) 7 (max poss 9) Traduzione codificante codone sensoSTOP 16 mRNA instabile per presenza di un codone di stop prematuro codificante indel > 60 Come sopra MS Il polipeptide presenta una singola sostit. aa, le conseguenze funzionali dipendono da sede e proprietà di aa. sostituito e aa. sostituente

HPFH  Hereditary Persistence of Fetal Haemoglobin In base all’evento mutazionale che ne è la causa può essere suddivisa in due categorie: forme dovute a delezione (di tratti più o meno estesi del cluster globinico) forme NON dovute a delezione (ndHPFH), quelle dovute a mutazioni del cluster b in genere presentano mutazioni in regioni regolative dei geni g

Lo studio delle Hb e dei loro geni ha portato contributi fondamentali in vari campi della biologia Studi biochimici di correlazione struttura-funzione

Scoperta del primo crossing-over dislocato (intragenico)  la Hb Lepore Scoperta della prima regione HSR (Hot Spot of Recombination)

Scoperta della prima regione HSR (Hot Spot of Recombination) Come si è arrivati alla scoperta della LCR delezioni diverse e loro conseguenze e studio dello stato cromatinico della regione Assenza dei geni  assenza delle catene globiniche I geni sono intatti ma le globine non vengono sintetizzate, perché?

Stamatoyannopoulos G (2005) – Exp Hematol 33: 259 Struttura della LCR  5 siti sensibili al trattamento con DNAsi I, ciascun sito è di 250 bp e contiene sequenze di legame per vari fattori di trascrizione La LCR è necessaria per l’espressione di TUTTI i geni del cluster e isola la regione dalla vicina cromatina inattiva Come agisce la LCR ? E’ stato dimostrato la LCR lega dei fattori di trascrizione e interagisce fisicamente con i promotori dei geni globinici (con un promotore alla volta)

Studi su topi transgenici Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ? Due meccanismi: Competizione tra geni Studi su topi transgenici Stamatoyannopoulos G (2005) – Exp Hematol 33: 259

Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ? Silenziamento di geni In topi transgenici con il solo gene e legato alla LCR il transgene viene espresso solo nel periodo embrionale  sequenze necessarie per il silenziamento sono state identificate sia nella parte distale che in quella prossimale del promotore Stamatoyannopoulos G (2005) – Exp Hematol 33: 259

Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ? In sintesi  di fondamentale importanza sono: La distanza dalla LCR La presenza di fattori di silenziamento La presenza di fattori di accensione gene-specifici (sicuramente per il b forse per il g) Periodo embrionale  il gene e viene espresso in quanto fisicamente più vicino alla LCR Periodo fetale  il gene e viene silenziato, la LCR agisce sul gene g che (forse) è attivato anche da fattori di trascrizione specifici Periodo adulto  il gene g viene silenziato, il gene b si lega a fattori di trascrizione specifici e su di esso agisce la LCR

Attualmente sono state indentificate varie proteine coinvolte nel silenziamento dei geni g o nell’accensione del gene b. Il fenotipo di soggetti portatori di vari tipi di talassemie dovute a delezione contribuisce a chiarire l’importanza di specifiche regioni del cluster per il legame di queste proteine Ghedira et al. (2013) – Hematologica 98: 305-308)

mRNA con codoni di STOP che cadono prima dell’ultimo esone sono instabili e vengono degradati  meccanismo attraverso il quale viene impedita la produzione di ‘monconi polipeptidici’ che potrebbero essere dannosi per la cellula NMD  Nonsense-Mediated Decay = degradazione mediata da codoni non-senso Quando gli mRNA arrivano nel citoplasma sono ancora legati, in corrispondenza dei punti di splicing, a complessi proteici (EJC = Exon Junction Complex) che vengono rimossi solo durante il primo round di traduzione. mRNA da cui non vengano rimossi gli EJC sono instabili e vengono degradati.

Frecce verdi  formazione di codoni di STOP prematuri prima dell’ultimo esone, mRNA instabili > non produzione di ‘tronconi polipeptidici’ Frecce rosse  formazione di codoni di STOP prematuri nell’ultimo esone, mRNA stabili > produzione di ‘tronconi polipeptidici’