L’emocromo è l’esame specialistico ed essenziale per l’ematologo Indica che: Il midollo produce un numero sufficiente di cellule mature di tutte le linee emopoietiche Lo sviluppo di ogni linea emopoietica è normale

EMOCROMO LA BUONA ESECUZIONE DEL PRELIEVO IL TEMPO DAL PRELIEVO L’ANTICOAGULANTE IDONEO QUANDO USARE Na-Citrato COME ANTICOAGULANTE

AUTOMAZIONE IN EMATOLOGIA I “citometri automatici” sono in grado di contare rapidamente un numero elevato di particelle e di valutarne le dimensioni Per queste caratteristiche possono in un tempo molto breve fornire molti parametri con qualità irraggiungibile dalle metodiche manuali

CONTATORE AUTOMATICO CAMPIONE Una porzione di sangue viene lisata per: misurare la concentrazione di emoglobina contare il numero di globuli bianchi Una porzione di sangue viene diluita per: - contare i globuli rossi - misurare il volume dei globuli rossi - contare le piastrine

LIC LUC Atyp Lympho IG NRBC HPC ALY HPX HPC BLASTI ALY PLT clumps Ogni tecnologia ha sviluppato degli allarmi suoi propri, di carattere generale oppure relativi ad anomalie specifiche, che traducono delle difficoltà incontrate nel classificare i leucociti di un dato campione. Le segnalazioni più frequenti sono dovute: alla presenza di elementi cellulari che creano delle interferenze nelle valli che separano i picchi di distribuzione sugli istogrammi ed i cluster cellulari sui citogrammi alla disomogeneità dei cluster cellulari (normalmente compatti) alla presenza di cluster cellulari in zone del citogramma normalmente non occupate.

GLOBULI ROSSI CONTEGGIO GLOBULI DOSAGGIO Hb MCV EMATOCRITO MCH MCHC PARAMETRI DIRETTI: CONTEGGIO GLOBULI DOSAGGIO Hb MCV PARAMETRI DERIVATI: EMATOCRITO MCH MCHC

GLOBULI ROSSI (fl = femtolitro) MCHC = Mean Corpuscolar Hemoglobin MCV = Mean Corpuscolar Volume (fl = femtolitro) MCH = Mean Corpuscolar Hemoglobin (valore emoglobina/numero globuli rossi x 10) MCHC = Mean Corpuscolar Hemoglobin Concentration (valore emoglobina/ valore ematocrito)

NOMENCLATURA ANISOCITOSI ANISOPOCHILOCITOSI MACROCITOSI MICROCITOSI IPOCROMIA IPERCROMIA MICROCITEMIA

CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME ERITROCITARIO

CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E CONCENTRAZIONE DI EMOGLOBINA macrocitosi ipocromia ipercromia microcitosi

MICROCITOSI Globuli Rossi = 4.710.000/ul HGB = 10.6 g/dL MCV = 70.0 fL

MACROCITOSI Globuli Rossi =2.820.000/μl HGB = 11,2 g/dL MCV = 121,4 fL

Densità (concentrazione Hb) V O L U M E Quanto detto sui processi di produzione, maturazione ed invecchiamento dei reticolociti e dei GBR è facilmente applicabile al cluster cellulare normale, ottenuto con la tecnologia dello scatter della luce laser, che può essere suddiviso in cellule con volume più elevato e a concentrazione emoglobinica più bassa (Reticolociti e neociti) cellule normocromiche-normocitiche (normociti) cellule di volume ridotto e a più elevata concentrazione emoglobinica (gerociti e sferociti) che presentano diverse caratteristiche volumetriche, di densità (o di concentrazione emoglobinica) ed anche biochimiche. Densità (concentrazione Hb)

Analisi RBC: citogramma volume/concetrazione Macro Micro Ipo Iper Y asse: Volumi X asse: densità celllulare

RETICOLOCITI IN AUTOMAZIONE PARAMETRO ESSENZIALE NELLA DIAGNOSI DELLE ANEMIE,ESPRIMONO LO STATO FUNZIONALE DELL’ERITROPOIESI LA STRUMENTAZIONE AUTOMATICA PERMETTE UN CONTEGGIO ATTENDIBILE POTENDO ANALIZZARE UN NUMERO DI EVENTI SIGNIFICATIVO

RETICOLOCITI IN AUTOMAZIONE METODO: COLORAZIONI (auramina O, arancio di tiazolo, oxazina, bleu di cresile) evidenziano l’RNA dei reticolociti PARAMETRI % , VALORI ASSOLUTI, IRF

Analisi Reticolociti High Angle (5-15 degrees) Oxazine 750 Absorption Bayer Core Technology 06/20/97 Analisi Reticolociti GATED High Angle (5-15 degrees) Oxazine 750 Absorption GLOBULI ROSSI RETICOLOCITI L : Retic maturi M : Retic a maturazione intermedia H : Retic più immaturi, com maggiore qtà di RNA 8

2,98%

AUTOMAZIONE IN EMATOLOGIA: FORMULA LEUCOCITARIA - Contare correttamente le cellule normali - Evidenziare la presenza di cellule patologiche -Identificare le cellule patologiche

FORMULA LEUCOCITARIA IN AUTOMAZIONE La presenza di cellule patologiche deve essere sempre confermata e valutata insieme a tutti i parametri dell’analisi dell’emocromo. L’identificazione del tipo di cellula patologica richiede ancor oggi l’uso di altri strumenti e/o di altre metodiche.

Formula leucocitaria misurata con metodo impedenziometrico 30 100 200 300 400 fL L’applicazione del metodo impedenziometrico a sospensioni di leucociti intatti permette di separare 2 popolazioni di cellule: La prima che ha un picco intorno a 250 fL e corrisponde a piccoli linfociti l’altra con picco intorno a 350-400 fL che corrisponde a monociti e granulociti. La discriminazione volumetrica fu migliorata con l’aggiunta di reagenti capaci di lisare parzialmente i leucociti così da svuotare il citoplasma del suo contenuto liquido. In tal modo la misurazione impedenziometrica del volume viene a riguardare fondamentalmente il nucleo con le eventuali granulazioni. Questo fu il primo metodo di differenziazione delle popolazioni leucocitarie impementato sugli strumento negli anni ’70. Le popolazioni identificate con questo sistema erano: I piccoli linfociti i granulociti una terza popolazione (cosiddetta di cellule medie) di volume intermedio costituita da monociti, basofili, parte degli eosinofili ma anche cellule atipiche come i grandi linfociti, i blasti, i granulociti immaturi.

Vo l ume Attività perossidasica

Intracellular Peroxidase Flow Cytometric Analysis 1 2 3 4 5

Tecnologia Baso BASOFILI MONO + LINFO NEUTR + EOSINO BLASTI

LINFOCITOSI LEUCOCITI = 16,600/μl LINFOCITI = 12,100/μl

LUC= 14,0% LEUCOCITI= 7.680

LEUCOCITOSI 149,000/μl LMC

Peripheral Blood

Peripheral Blood

Basophil granulocyte

CONTEGGIO PIASTRINE QUANDO NON E’ INDICATO L’ANTICOAGULANTE EDTA IMPORTANZA DELLA BUONA ESECUZIONE DEL PRELIEVO QUANDO NON E’ INDICATO L’ANTICOAGULANTE EDTA

PARAMETRI PIASTRINICI MPV = MEAN PLATELET VOLUME PDW = PLATELET DISTRIBUTION WIDTH PCT = PLATELETCRIT SONO FORTEMENTE INFLUENZATI DALLE CONDIZIONI E DAL TEMPO DI ESECUZIONE DEL PRELIEVO

METODO ADVIA volume densità RBC GHOST: membrane dei GR svuotate, in seguito ad emolisi. Le griglie sono generate dagli indici di rifrazione. RBC fragments: pezzi di GR ancora funzionanti come gli schistociti. Non sono rifrangenti. Anche in questo caso è la mappa di MIE; è il prolungamento del grafico RBC scatter. Sell’asse X ci sono i segnali di High angle ( densità ) e sull’asse Y ci sono i segnali di low angle (volume). densità

PIASTRINE = 2,000/μl

Conteggi piastrinici non attendibili si ottengono quando sono presenti aggregati, oppure piastrine giganti,oppure microciti o frammenti di eritrociti o leucociti

PIASTRINE 78,000/μl AGGREGATI PIASTRINICI

Ethnic differences in normal blood cell values Men Women Caucasian n=100 Afrocarribean n=51 African n=65 n=50 White cell count* 5.7(3.6-9.2) 5.2(2.8-9.5) 4.5(2.8-7.2) 6.2(3.5-10.8) 5.7(3.3-9.9) 5.0(3.2-7.8) Neutrophil count 3.2(1.7-6.1) 2.5(1.0-5.8) 2.0(0.9-4.2) 3.6(1.7-7.5) 3.0(1.4-6.5) 2.4(1.3-4.2) Lymphocyte count 1.7(1.0-2.9) 1.9(1.0-3.6) 1.8(1.0-3.2) 1.8(1.0-3.5) 2.0(1.2-3.4) 2.0(1.1-3.6) Monocyte 0.34(0.18-0.62) 0.33(0.18-0.52) 0.29(0.15-0.58) 0.30(0.14-0.61) 0.31(0.16-0.59) 0.28(0.15-0.39) Eosinophil count 0.12(0.03-0.48) 0.13(0.03-0.58) 0.12(0.02-0.79) 0.13(0.04-0.44) 0.10(0.03-0.33) 0.10(0.02-0.41) Platelet count 218(143-332) 196(122-313) 183(115-290) 246(149-374) 236(149-371) 207(125-342)

Mean cell volume (MCV) fl Mean cell Hb conc (MCHC) g/l Hematological values for normal infants and children. Amalgamation of data derived from various sources, expressed as mean ± 2SD or 95% range Birth Day 3 1 month 2 months 3-6 months 1 year 2-6 years 6-12 years Red cell count x 1012/l 6.0±1.0 5.3±1.3 4.2 ±1.2 3.7± 0.6 4.7± 0.6 4.5 ±0.6 4.6± 0.6 4.6 ±0.6 Hemoglobin g/l 180 ±40 180± 30 140± 25 112± 18 126 ±15 125 ±15 135 ±20 Packed cell volume (PCV) l/l 0.60± 0.15 0.56± 0.11 0.43 ±0.10 0.35 ±0.07 0.35 ±0.05 0.34 ±0.04 0.37 ±0.03 0.40± 0.05 Mean cell volume (MCV) fl 110 ±10 105±13 104±12 95±8 76±8 78±6 81±6 86±9 Mean cell Hb (MCH) pg 34±3 33±3 30±3 27±3 27±2 29±4 Mean cell Hb conc (MCHC) g/l 330± 30 330± 40 320± 35 340± 20 340± 30 Reticulocytes x 109 /l 120-400 50-350 20-60 30-50 40-100 30-100 White cell count 18±8 15±8 12±7 10±5 12±6 11±5 9±4 Neutrophils 4-14 3-5 3-9 1-5 1-6 1-7 1.5-8 2-8 Lympocytes 3-8 3-16 4-10 4-12 3.5-11 6-9 Monocytes 0.5-2.0 0.5-1.0 0.3-1.0 0.4-1.2 0.2-1.2 0.2-1.0 Eosinophils 0.1-1.0 0.1-0.2 Platelets 150-450 210-500 210-650 200-550 200-450 180-400