Esercitazioni di Biochimica Applicata Introduzione alle metodologie di base per l’analisi delle proteine 1. Dosaggio quantitativo delle proteine totali in un campione biologico; Proteine cellulari - tecniche di omogeneizzazione e centrifugazione: arricchimento della/le proteina/e studiate in frazioni sub-cellulari ottenute da omogenato d’organo, tessuto, linee cellulari; Saggio analitico nella frazione subcellulare (saggio enzimatico); Cinetica enzimatica; Procedure di separazione delle proteine in studio (elettroforesi su gel) Analisi di proteine specifiche o totali nei diversi tessuti e distretti anatomici, in liquidi biologici e colture cellulari: tecniche separative più risolutive, metodi di identificazione e purificazione. In particolare: Western blot, elettroforesi bidimensionale, proteomica, tecniche cromatografiche, purificazione all’omogeneità, sequenziamento. Tecniche mirate

Il dosaggio quantitativo delle proteine viene applicato: per conoscere quante proteine sono presenti in un determinato preparato biologico, prima di procedere verso ulteriori analisi relative ad una o più proteine; esempi: per calcolare l’attività specifica durante i saggi funzionali (es. per vel. enzimatica); per calcolare la densità specifica di un recettore nei saggi di legame (binding) dei recettori proteici; come indice di purezza/resa della proteina studiata durante le fasi progressive di purificazione; prima di una separazione cromatografica o elettroforetica (SDS-PAGE, Western blot, proteomica).

Dosaggio della concentrazione di proteine totali in un campione biologico Metodi chimici: Metodo Kjeldahl (N totale) Metodi spettrofotometrici: -metodo in assorbanza UV a 280 nm (amminoacidi aromatici) - Metodi colorimetrici: Metodo del biureto; Metodo di Lowry; Metodo BCA (acido bicinconinico); Metodo di Bradford; Metodi turbidimetrici: precipitazione in acidi TFA o TCA e analisi turbidimetrica del precipitato.

Metodo di Kjeldahl Determinazione dell’N proteico trasformato in gr proteine mediante un fattore di conversione- Per incrementarne l’accuratezza: precipitazione delle proteine con TCA, TFA o PCA, lavaggio per centrifugazione e precipitato usato per l’analisi successiva: 1) Digestione: il campione con le proteine viene portato ad alta temperatura in presenza di H2SO4 concentrato + catalizzatore (ex. Cu2SO4) + ossidanti (ex. permanganato o H2O2); tutto l’N organico si trasforma in NH4+, ossidazione di C e S a CO2 e SO2; 2) Distillazione: (NH4)2SO4 formato + 2NaOH = 2NH3 (raccolta x distillazione) + Na2SO4 + 2 H2O; 3) Titolazione: NH3 raccolta e titolata per aggiunta di acido forte (ex. HCl) a titolo noto. Calcolo del contenuto di azoto o di proteine in un campione 1 mol HCl = 1 mol NH3= 14 gr N Quantità di N nel campione in gr: ml HCl x M HCl x 14/1000 Quantità di proteine nel campione in gr: ml HCl x M HCl x 14/1000 x 100/16 se si considera che il contenuto medio di N proteico è 16%.

Metodi spettrofotometrici - colorimetrici

I 20 L-amminoacidi che formano le proteine Legame peptidico Dosaggio proteine Metodi spettrofotometrici basati su reazioni che possono coinvolgere il legame peptidico o i gruppi –R di alcuni AA da: www.vialattea.net

PARAMETRI CHE CARATTERIZZANO I DIVERSI METODI DI Metodi spettrofotometrici PARAMETRI CHE CARATTERIZZANO I DIVERSI METODI DI DOSAGGIO DELLE PROTEINE Sensibilità: quantità più piccola di proteine determinabile nel campione biologico; Specificità: capacità di quantificare solo le proteine del campione; Interferenze: queste possono alterare sia accuratezza che specificità del metodo: es.: assorbimento alla l analitica di componenti del campione diverse dalle proteine (es. acidi nucleici); interferenze del mezzo, ex. sali del tampone, con la formazione di complessi colorati (metodi colorimetrici); Capacità relativa o assoluta di misurare le proteine del campione biologico: dipendenza dalla composizione in certi aminoacidi delle proteine o meno: metodo relativo, metodo assoluto; importante durante procedura di purificazione. Integrità del campione: capacità o meno di lasciare integro il campione con possibilità di utilizzarlo in altri dosaggi; Stabilità: metodi colorimetrici, stabilità nel tempo dei complessi colorati.

Integrità del campione: si Stabilità: si Interferenza con: ASSORBANZA IN UV DELLE PROTEINE Caratteristiche: Sensibile: 10-20 mg Integrità del campione: si Stabilità: si Interferenza con: basi azotate acidi nucleici (si corregge a 260 e 280 nm) Metodo relativo: può variare in base al tipo di proteine presenti.

quali i metodi del Lowry e del BCA. Metodi colorimetrici Metodo «capostipite» di altre tecniche colorimetriche, quali i metodi del Lowry e del BCA. Caratteristiche: Integrità campione: no Metodo ritenuto assoluto, più costante di UV . Scarsa sensibilità Reattivo di Benedict: solfato di rame CuSO4 in soluzione alcalina e sali citrato o tartrato di K+ o Na+

Integrità campione: no Metodo di Folin classico: Residui fenolici quali gruppi –R di AA aromatici (specialmente tirosina) , sono ossidati da reattivo di Folin-Ciocalteu in ambiente alcalino: acidi fosfotungstico-molibdico del reagente si riducono a composti di colore blu. Il Lowry incrementa sensibilità associando biureto e Folin. Caratteristiche: Integrità campione: no Stabilità e tempistica: stabile entro limiti di tempo, lettura dopo 30 min. Procedura relativamente lunga. Metodo ritenuto più costante specifico e sensibile rispetto a UV, Folin classico e biureto.

Integrità campione: no Stabilità: buona. Tempistica: procedura lunga. Interferenze: lipidi, detergenti, EGTA; DTT (ditiotreitolo >1mM). Migliore del Lowry per detergenti, sali etc.. rid Quota di ioni rameici ioni rameosi dalle proteine in ambiente alcalino. L’acido BCA chela ioni rameosi formando un complesso colorato molto stabile.

Interferenze con detergenti Residui di arginina, triptofano, tirosina e fenilalanina Integrità campione: no Stabilità: più stabile degli altri metodi; rapidità di esecu- zione – non richiede incubazione dopo aggiunta reagente. Metodo relativo- Sensibilità comparabile a Lowry Interferenze con detergenti

Metodo del Biureto: retta di calibrazione – due l analitiche, a sensibilità diversa: 545 nm, quantità di proteine misurabile: 1 – 5 mg 330 nm, quantità di proteine misurabile: 0.1-1 mg Retta a 330 nm

Metodo del Bradford: retta di calibrazione – l analitica: 595 nm