Frazionamento di un lisato cellulare tramite CENTRIFUGAZIONE Capitolo 3 Centrifugazione preparativa e analitica

1. Centrifugazione preparativa Centrifugazione preparativa permette di separare i vari elementi di un omogenato cellulare Centrifugazione analitica è utilizzata principalmente per gli studi di macromolecole purificate o di complessi sovramolecolari isolati 2. Ultracentrifugazione analitica

Centrifughe preparative Centrifughe da tavolo Massimo volume di carico: 24 microprovette da ml 1,5/2.0 Massima velocità (RPM): 13300 Massima accelerazione centrifuga Centrifuga tipo sorvall

Ultracentrifuga analitica Puo’ operare a velocita’ di 700.000 rpm (500.000g) Il rotore e’ contenuto in una camera blindata, refrigerata e sottovuoto. Il rotore è fatto in un materiale particolarmente resistente Es. TITANIO La sedimentazione è controllata da un sistema ottico per consentire l’ osservazione del materiale che va sedimentandosi

Ultracentrifugazione analitica viene utilizzata per determinare: -il grado di purezza di una macromolecola -la massa molecolare relativa di soluti nel loro stato nativo -le costanti di affinità tra ligandi e proteine -esaminare i cambiamenti di massa molecolare relativa di complessi sovramolecolari - studiare i cambiamenti conformazionali

separazione differenziale Tipi di rotori Rotore Verticale Centrifugazione isopicnica Rotore a bracci Oscillanti Centrifugazione isopicnica massima risoluzione delle bande Rotore ad angolo fisso separazione differenziale Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

Che cosa è il campo centrifugo?

Una qualsiasi particella che viene fatta ruotare all’interno CAMPO CENTRIFUGO: Una qualsiasi particella che viene fatta ruotare all’interno di un rotore da centrifuga avrà una velocità di sedimentazione che sarà pari al campo centrifugo G applicato G = w 2r w = velocita’ angolare del rotore espressa come 2p rad r = distanza radiale (cm) della particella dall’asse di rotazione Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

velocità del rotore in giri al min= rev min-1=r.p.m. la velocita’ angolare (w) del rotore si può esprimere come velocità del rotore in giri al min= rev min-1=r.p.m. Una rivoluzione del rotore e’ pari a 360°= 2p rev min-1 =2p r.p.m. 2p r.p.m. 60 da cui la velocità angolare rad sec-1 w = Campo centrifugo G = w 2r = 2p r.p.m. 60 r = distanza radiale della particella dall’asse della rotazione espressa in cm 4p 2 (r.p.m.)2 3600 r 2 =

Campo centrifugo relativo (RCF) campo gravitazionale terrestre g = 981 cm s -2 si esprime in g = il rapporto tra campo centrifugo G , a uno specifico raggio, e la velocità all’accellerazione normale g=981 RCF=G = w 2r = 4p 2 (r.p.m)2 r 3600 x 981 g = = 1.12x10-5 r.p.m2 r RCF= = 1.12x10-5 r.p.m.2 r RCF = rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo e il peso della particella in presenza della sola forza di gravita’

che permettono di trasformare r.p.m in g Velocità del rotore (r.p.m) Le centrifughe sono provviste di NOMOGRAMMA che permettono di trasformare r.p.m in g NOMOGRAMMA Velocità del rotore (r.p.m) Forza centrifuga relativa Distanza radiale (mm) RCF (xg) Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

Una volta stabilito che cosa è il campo centrifugo Ci interesserà sapere quali leggi governano la sedimentazione Di una particella in quel determinato compo centrifugo relativo

Una miscela di particelle eterogenee, approssimativamente sferiche, può essere separata mediante centrifugazione, in base alla : 1. densità 2. dimensione delle particelle, 3. tempo di sedimentazione, 4. livello di sedimentazione raggiunto dopo un periodo di tempo definito..

La velocita’ di sedimentazione n di una particella e’ proporzionale alle sue dimensioni, alla differenza tra le densita’ di particella e mezzo e al campo centrifugo applicato n =2rp2(rp -r m ) w2 r 9h h= coef . di viscosita’ del mezzo rp =densita’della particella r m=densita’ del mezzo rp=raggio della particella Legge di STOKES La velocita’ di sedimentazione dipende anche dalla forma della particella: una particella allungata offre maggior attrito rispetto ad una con la stessa massa ma di forma globulare quindi le particelle allungate sedimentano piu’ lentamente

La velocita’ di sedimentazione di una particella disciolta in una soluzione dipendera’ non solo dal campo centrifugo applicato ma anche dalla: 1.massa della particella In sommario: 2.Densita’ e viscosita’ del solvente in cui avviene la sedimentazione e 3.dalla sua forma (sferica o allungata) Quando si riportano le condizioni per la separazione di particelle bisogna quindi specificare: la velocita’ del rotore, dimensioni dell raggio (o tipo di rotore) tempo di centrifugazione

Coefficienti di sedimentazione E’ espresso in secondi e dipende dalla Il coefficiente di sedimentazione s È dato dalla velocità di sedimentazione v su campo centrifugo G applicato s = v/ G = v/w2 r E’ espresso in secondi e dipende dalla temperatura densita’ viscosita’ del mezzo Per convenzione si usa esprimere il coefficiente di sedimentazione trovato sperimentalmente in quel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui viscosita’ e densita’ fosse pari all’ acqua a 20°C

Coefficienti di sedimentazioni standard = Svedberg units vescicole xg unita’ Svedberg Es. 5S RNA =5x10-13 sec 1unita’ Svedberg = 10-13 sec Coefficienti di sedimentazioni standard = Svedberg units Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

Segue…CENTRIFUGAZIONE

Frazionamento cellulare Nuclei (P1) Vescicole secretorie (P3) Apparato del Golgi (P2) ~2µm = GFP-Sec2p DAPI

Centrifugazione differenziale LT S1 S2 S1 S2 10g P2 P1 P3 500g 35000g e’ la sedimentazione successiva di particelle aventi dimensione e densità diverse

Lisato P1 S1 S2 P2 P3 S3 6500g 13000g Es. schematico di centrifugazione differenziale di un lisato cellulare: PM, Nucleo Mitocondri ER, Golgi Vescicole ER, Golgi Membrane frammentate 100000g P1 S1 LT P2 S2

Centrifugazione differenziale di GFP-Mlc1p e Sec4p Esempio di Centrifugazione differenziale di GFP-Mlc1p e Sec4p CE from wt cells expressing GFP-Mlc1p P1/ S1= 6.250xg P2/ S2 = 35.000xg P3/ S3= 100.000xg Pdr5p : PM protein Sec61p :ER +Golgi protein Sec4p : vesicles and cytosol

Centrifugazione in gradiente di densita’: Tecnica zonale di velocita’ e isopicnica 1. Nella tecnica zonale di velocita’ le particelle si separano principalmente per differenza di dimensioni, perchè particelle biologiche di tipo simile sono spesso simili in forma e la loro densita’ rientra in una gamma ristretta. 2.Nella tecnica isopicnica: la separazione dipende dalla densita’ idrostatica delle particelle e non dalla forma ne’ dalla dimensione ed e’ indipendente dal tempo: Questa tecnica viene utilizzata per separare particelle di dimensioni simili ma di diversa densita’

Materiali usati per la formazione dei gradienti La scelta del soluto dipende dalla natura delle particelle da separare Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

Separazione di velocita’ su gradiente di densita’ Campo centrifugo campione Il campione viene fatto stratificare su un gradiente pre-formato la cui densita’ massima non deve superare quella delle particelle piu’ dense da separare Nota: Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili non sono ben separati con questo metodo Particelle a bassa densita’ Particelle ad alta densita’ Separazione isopicnica zonale di velocità: la corsa deve essere terminata prima che le particelle raggiungano la base del tubo

Il gradiente non è preformato ma si genera durante Centrifugazione isopicnica all’equilibrio Il gradiente non è preformato ma si genera durante la centrifugazione Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili sono separati con questo metodo

Centrifugazione isopicnica con metodo dell’isodensita’ all’equilibrio Campo centrifugo Il gradiente si forma durante la centrifugazione Particelle a bassa densita’ Particelle ad alta densita’ La centrifugazione va fatta all’equilibrio (densita’ idrostatica = a quella dell gradiente) Campione +mezzo Il campione viene mescolato con il mezzo del gradiente

Centrifugazione isopicnica con metodo all’equilibrio Campo centrifugo Particelle a bassa densita’ G R A D I E T Particelle ad alta densita’ campione Il campione viene stratificato sotto (o sopra) il gradiente la cui densita’ massima deve superare quella delle particelle piu’ dense da separare TEMPO di centrifugazione La centrifugazione va fatta all’equilibrio (densita’ idrostatica = a quella del gradiente) Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili sono separati con questo metodo

wt cells expressing GFP-Mlc1p Esempi di Sucrose Velocity gradient wt cells expressing GFP-Mlc1p

wt cells expressing GFP-Mlc1p Esempi di Density gradient Gradiente di saccarosio 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 frazioni wt cells expressing GFP-Mlc1p Cellule wt +GFPMlc1p Gradiente di saccarosio

Metodi di determinazione della concentrazione di proteine nel lisato cellulare Paragrafo 8.3.2

Metodi colorimetrici: La soluzione proteica reagisce con un reagente che da luogo ad un prodotto colorato. La quantita’ del prodotto viene quindi determinata allo spettrofotometro. Con appropriata calibratura si correla l’ intensita’ della colorazione alla quantita’ della proteina Metodi colorimetrici: Metodo di Lowry, BCA e Bradford.

Metodo di Bradford Questo metodo si basa sul legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine (non molto accurato, poco sensibile 20g/cm3) E’ basato sull’ immediato shift di assorbimento da 465nm a 595 nm che occorre quando il colorante Comassie Brilliant blue G-250 si lega alle proteine in soluzione acida. Protein + Comassie brilliant blue Protein Dye complex (acidic, A465nm) (A595nm) Si assume che il colorante si leghi alla proteina via attrazione elettrostatica dei gruppi acidi sulfonici del colorante. Gli studi sul meccanismo della formazione di questo complesso suggeriscono che la forma anionica del colorante e’ la specie che complessa con la proteina. Questa interazione causa lo shift di assorbimento con un picco a 595nm

rileva quantitativi proteici inferiori a 10µg/cm3. Metodo di Lowry: rileva quantitativi proteici inferiori a 10µg/cm3.   Schema di reazione Lowry modificato = prodotto +stabile Proteine+Cu+ OH- complesso tetracoordinato-Cu+1   + Folin fenolo+ Acido Fosfomolibdenico / fosfotugstenico complesso colorato Blu A750nm Le proteine si fanno reagire con una soluzione alcalina contenente solfato di rame in presenza di tartrato (reagente di Folin: tugstato, molibdato e fosfato di sodio) si sviluppa un colore blu porpora che assorbe ad un massimo di A 660nm Interference.: con tamponi Tris, e zwitterionici (PIPES, HEPES) o contenenti EDTA

Assorbimento della luce ultravioletta: 1 utile per piccole quantita’ di proteine e per riutilizzare il campione (sensibilita’ fino a 10g/cm3) I residui aromatici della tirosina e triptofano hanno un assorbimento max a 280nm. In una miscela complessa si puo’ calcolare con buona approssimazione che una soluzione con A280= 1.0 (considerando 1cm di percorso) abbia una concentrazione proteica di circa 1mg/cm3 1 Attenzione : questo metodo e’ soggetto ad interferenza. es.: anche gli acidi nucleici assorbono a 280nm Fattore di correzione: Proteine mg/cm3 =1.55A280-0.76A260

Misurazione dell’ assorbanza dei legami peptidici a 205-210nm. 2 Questo metodo ha una sensibilita’ maggiore fino a >1g/cm3. Nota che: I legami peptidici assorbono ad un massimo di 190nm ma gli spettrofotometri hanno scarsa resa a queste lunghezze d’onda applicazioni: FPLC= Fast Protein liquid chromatography HPLC= High Performance Liquid Chromatography

METODI DI FRAZIONAMENTO delle proteine Paragrafo 8.3.4

Frazionamento stabilità : -denaturazione tramite temperatura Frazionamento per solubilità e/o idrofobicità : --Sali, -solventi organici, -punto isoleletrico, Frazionamento per carica: -colonne a scambio ionico

Fattori che diminuiscono la stabilità delle proteine: Frazionamento per STABILITA’ Fattori che diminuiscono la stabilità delle proteine: -Temperatura -Congelamento -Scuotimento -pH dei buffer di solubilizzazione -Ossidazione -Presenza di metalli come co-fattori -Sali

SOLUBILITA’ differenziale delle proteine Può essere un criterio di purificazione di proteine da una miscela complessa Pag 345-348 Precipitazione delle proteine meno solubili più solubili della proteina d’interesse Figures from:http://biotecnologie.unipr.it/didattica/att/5cc0.file.doc

Frazionamento per solubilità e/o idrofobicità Precipitazione delle proteine -Precipitazione con Sali -Precipitazione con Solventi organici -Precipitazioni con PEG

Perche’ in presenza di sali o metanolo le proteine precipitano?   quindi la loro solubilita’ sara’ diversa in presenza di concentrazioni diverse di sali o solventi organici. Le proteine differiscono nel numero di gruppi polari esposti al solvente Precipitazione della proteina d’interesse http://biotecnologie.unipr.it/didattica/att/5cc0.file.doc % del solvente

Una proteina e’ solubile in acqua fintanto che i gruppi carichi sono solvatati da molecole di acqua e i gruppi idrofobici sono mantenuti all’ interno della proteine. I gruppi idrofobici sono rivolti verso l’interno I gruppi idrofilici sono rivolti verso l’esterno. Questo permette interazioni dipolari con il solvente H O- +

PRECIPITAZIONE CON SALI In una soluzione acquosa contenente proteine e sali .. Se si aumenta la concentrazione di sali le molecole libere di H2O che possono solvatare gli ioni salini diminuiscono. Le prime molecole di H2O che si rendono disponibili a questo punto sono quelle che si trovano intorno ai gruppi idrofobici delle proteine poiche’ le altre sono impegnate con interazioni elettrostatiche con i gruppi polari delle proteine e quindi sono piu’ difficilmente cedibili.

Na+-Cl- H O- + H O- + Na+-Cl- Na+-Cl- H O- + H O- + H O- + Na+-Cl- I gruppi idrofobici sono rivolti verso l’interno I gruppi idrofilici sono rivolti verso l’esterno. H O- + H O- + H O- + Na+-Cl- Na+-Cl- al crescere della concentrazione salina i gruppi idrofobici delle proteine vengono scoperti

Questi frammenti idrofobici esposti causano l’ aggregazione delle proteine e a seguito di interazioni idrofobiche che e causano la precipitazione delle proteine o ‘salting out’ . Precipitazione delle proteine meno solubili più solubili della proteina d’interesse Schema di percipitazione in presenza di Ammonio solfato Naturalmente più la proteina contiene tratti idrofobici e’ piu’ risultera’ insolubile a basse concentrazioni saline (e vice versa).

PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI In una soluzione acquosa contenente solventi organici (metanolo, etanolo, butanolo, acetone) le molecole di acqua si dispongono a idratare le molecole di solvente organico. L’ acqua di solvatazione viene quindi rimossa dai gruppi carichi e polari sulla superficie delle proteine.   I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti e le proteine si aggregano per formazione di interazioni ioniche tra le molecole proteiche.

di interazioni ioniche tra le molecole proteiche I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti e le proteine si aggregano per formazione di interazioni ioniche tra le molecole proteiche H O - + I gruppi idrofobici sono rivolti verso l’ interno idrofilici esterno . H O - +

Di conseguenza le proteine presenti in una soluzione acquosa contenente solventi organici precipitano H O - + in ordine decrescente a seconda del numero di gruppi carichi presenti sulla loro superficie e in misura maggiore man mano che aumenta la concentrazione del solvente

Poly(ethylene glycol) (PEG) : HO - (CH CH O) CH CH - OH 2 2 n 2 2 Il PEG e ’ un polimero organico che precipita le proteine con un meccanismo simile a quello dei solventi organici richiede concentrazioni piu ’ basse per precipitare le proteine e ha minor probabilita ’ di determinare la loro denaturazione . PEG puo’ essere usato 1 . per guidare le proteine e acidi nucleici a formare cristalli . 2. Per purificazioni proteiche : PEG + destrano + buffer -- > e’ un sistema bi - fasico utile per ospitare materiali biologici 3.per aiutare la fusione cellulare . Il PEG interagisce con le membrane cellulari , a un processo chiave usato in biotecnologia . 4. Il legame covalente del PEG alle proteine da coniugati che non sono " - immunogenici " e antigenici = uso in vaccini . 5. Il legame covalente del PEG a superficie retarda l’ assorbimento delle proteine a queste superfici

Altri metodi di frazionamento delle proteine Frazionamento per dimensioni: centrifugazione, cromatografia a settaccio molecolare, Frazionamento per affinità : Co-immunoprecipitazione utilizzando interazione tra antigene-anticorpo colonne di affinità per cofattori