Appunti di Microbiologia Informazioni: Prof Eugenio Debbia Università di Genova Scuola di Scienze Mediche e Farmaceutiche DISC-Sezione di Microbiologia, Largo Rosanna Benzi 10,16132 Genova Tel: 010-353 38136, 329 260 5218 FAX: +39-010-353 7651 http://www.microbiologia.unige.it/dpb/indexxx.htm e-mail: eugenio.debbia@unige.it W. Churchill

Testi consigliati.  Antonelli et al. Principi di Microbiologia Medica II ed. CEA 2012 La Placa Microbiologia Medica. Edises 2014 Jawetz et al. Microbiologia Medica. Piccin 2012

Protozoi e altri parassiti MICROBIOLOGIA Batteri Virus Miceti Protozoi e altri parassiti Batteri: microorganismi con struttura cellulare procariotica. Unicellulari senza m. nucleare, senza REG, REL e Golgi, alcuni sopravvivano come intracellulari obbligati. Virus: diametri tra 18 e 300 nm. organizzazioni biologiche caratterizzate da un livello sub-cellulare di struttura. Costituiti da DNA/RNA e proteine. Parassiti intracellulari obbligati Miceti: microorganismi eucarioti unicellulari (lieviti), spesso organizzati in strutture pluricellulari filamentose (muffe). Alcuni dimorfi (entrambe le morfologie). Più complessi: nucleo, mitocondri, REG, REL Golgi Protozoi: microorganismi eucarioti unicellulari 1-2 micron di diametro e altri parassiti come artropodi e cestodi

BATTERI dimensioni Cellula Eucariotica Cellula procariotica Nucleo

STRUTTURA INTERNA DELLA CELLULA MICROBICA a) CELLULA PROCARIOTICA b) CELLULA EUCARIOTICA Membrana citoplasmatica Reticolo endoplasmatico Citoplasma Nucleoide Ribosomi Ribosomi Nucleo Nucleolo Membrana nucleare plasmide Citoplasma Parete cellulare Membrana citoplasmatica Cromosoma Batterico: Diffusa basofilia del citoplasma-Anni ‘30-’40: presenza di frazioni positive alla reazione di Feulgen -Lisando le cellule è possibile osservare il DNA in Microscopia elettronica:Molecola circolare 1100-1400m-Più di 1 cromosoma-Un carattere peculiare del cromosoma batterico è rappresentato dal fatto che è collegato alla m.p. in zone caratteristiche-plasmidi Granulazioni: materiali di riserva (glicogeno, polifosfati, polisaccaridi)-Assenza di vacuoli e correnti Ribosomi (60% RNA-40% proteine. 30S: 21 proteine e RNA 16S e 50S: 34 proteine e RNA 5S e 23S) Ribosomi batterici = ribosomi mitocondri e cloroplasti Mitocondrio Cloroplasto

localizzazione delle macromolecole nella cellula batterica Composizione: H2O (80%), K, Na, Mg, Ca, Fe, Zn, P, S e macromolecole organiche localizzazione delle macromolecole nella cellula batterica Parete Membrana Flagello Citoplasma Polisaccaridi Proteine Granuli D’accumulo Il più cospicuo dei componenti cellulari è l’acqua che da sola può rappresentare l’80% del peso. Non tutta l’acqua è libera, ma può essere legata a componenti cellulari che sono pertanto idratati e a cui l’acqua conferisce particolari caratteristiche fisiche-chimiche. I componenti inorganici piùimportanti sono K, NA, Mg, Ca, Fe, Zn, P, S Sostanze organiche a basso p.m e macromolecole Nonostante nella cellula siano presenti alcuni monomeri caratteristici la cell batt. È costruita con gli stessi materiali che si ritrovano in tutte le altre cellule. Ribosomi Nucleoide Acidi nucleici Lipidi

G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G. M G. Antonelli, M. Clementi, G. Pozzi, G.M. Rossolini     Principi di Microbiologia medica, II ed.     Copyright 2011 C.E.A. Casa Editrice Ambrosiana

Batteri: microorganismi con struttura cellulare procariotica Virus: organizzazioni biologiche caratterizzate da un livello sub-cellulare di struttura Miceti: microorganismi eucarioti unicellulari, spesso organizzati in strutture pluricellulari Protozoi: microorganismi eucarioti unicellulari

IL MICROSCOPIO OTTICO Vite macrometrica: è la  manopola di regolazione grossolana della messa a fuoco. Vite micrometrica: permette la regolazione fine della messa a fuoco.    Regolatore dell’intensità luminosa: permette di variare l’intensità luminosa del campo.

COLORAZIONE semplice DELLE CELLULE PER L’OSSERVAZIONE MICROSCOPICA Strisciare la coltura su un vetrino Formando uno strato sottile Ricoprire il vetrino con colorante Risciacquare e asciugare Potere di risoluzione del microscopio ottico 0,15 micron, otteniamo informazioni circa le dimensioni la forma e l’aggruppamento Asciugare all’aria 100x Vetrino Olio Porre una goccia d’olio (da immersione) sul vetrino; osservare con l’obiettivo 100x Passare il vetrino sulla fiamma per fissare il campione

COLORAZIONE DI GRAM (complessa o differenziale) Ricoprire lo striscio fissato al calore con cristal-violetto per 2-3 minuti Fase 1 Tutte le cellule si coloreranno di viola Fase 2 Aggiungere soluzione iodata per 1 minuto Le cellule rimarranno viola Fase 3 Decolorare in alcool per circa 1-2 minuti Le colorazioni differenziali consentono di evidenziare differenze di colorazione e talvolta strutture intracellulari Gram: patologo danese che ha messo a punto la colorazione alla fine dell’800 Il mordenzante (iodio + ioduro di K in acqua: liquido di Lugol) forma un composto insolubile Gram+ il decolorante non asporta il complesso cristalvioletto-iodio (- permeabili) Gram- il decolorante asporta il complesso cristalvioletto-iodio (+ permeabili) Le cellule Gram-positive risulteranno viola, quelle Gram-negative incolori Colorare con fucsina per 1-2 minuti Fase 4 G- Le cellule Gram-positive (G+) risulteranno viola, quelle Gram-negative (G-) avranno una tonalità da rosa a rosso G+

La colorazione di Gram Un Gram positivo Un Gram negativo Nell’osservazione di preparati colorati fissati o non in genere si usa l’obiettivo ad immersione. Cocchi Gram positivi Cocchi Gram positivi Bastoncelli Gram negativi misti a cocchi Gram positivi

Colorazione di Ziehl-Neelsen (bacilli alcool-acido resistenti) Fucsina fenicata a caldo 5 m Acido solforico (20%) 30’’ Alcool 30’’ Blu di metilene 1 m

Batteri alcool-acido resistenti: rossi su fondo blu azzurro

Osservazione a contrasto di fase Un lievito (S. cerevisiae), 400x Un batterio (L. sakei), 400x Una muffa (G. candidum), 400x Un attinomicete 400x Un lievito (Y. lipolytica) 400x Una muffa (R. oligosporus), 400x

Osservazione in campo scuro

Anatomia della cellula batterica Schematicamente dall'esterno verso l'interno i batteri presentano: a) glicocalice o slime b) capsula c) flagelli, pili o fimbrie d) involucro (parete in generale) totalmente diverso tra gram-positivi e gram-negativi (tale differenza è messa in rilievo proprio dalla colorazione di Gram) e) membrana citoplasmatica f) mesosomi g) citoplasma cromosoma o altro materiale genetico accessorio: es. plasmidi. ribosomi corpi inclusi

Materiale stratificato intorno alla cellula Glicocalice Materiale stratificato intorno alla cellula Strato S: distribuzione regolare (cristallina) di sub-unità glicoproteiche Capsula: matrice fibrosa costituita da polimeri di carboidrati La capsula ha attività antifagocitaria, ben sviluppata in klebsiella, pneumococco, emofilo, pseudomonas. È essenziale per la formazione di biofilm e può adsorbire notevoli quantità di alcuni atb. I ceppi di pseudomonas mucoidi sono resistenti a concentrazioni di gentamicina e carbenicillina attive sui non mucoidi. Colorazione negativa

Flagelli Moto browniano Movimento attivo Flagello: unico filamento sprovvisto di membrana – flagellina- (diversa in specie batteriche diverse) chemiotassi Tutti i batteri sospesi in un liquido isotonico sono animati da movimenti oscillatori Tipici di bacilli, vibrioni e spirilli

STRUTTURA DI UN FLAGELLO BATTERICO Filamento Flagellina Uncino Membrana Esterna LPS Anello L Anello P Nel flagello si distinguono 3 porzioni: filamento, uncino o gancio e corpo basale: bastoncello che si innesta nella cellula e 4 annelli : L (strato lipidico membrana esterna), P (peptidoglicano) MS sopra e sotto membrana plasmatica Peptidoglicano Periplasma Anello MS Membrana citoplasmatica Proteina Fli invertitore del motore Proteina Mot

Pili o Fimbrie Le fimbrie sono appendici diverse dai flagelli, sono costituite da una proteina detta pilina che gioca un ruolo fondamentale nel processo di adesione dei batteri ad altre cellule (patogenicità). Spesso sono codificati dai plasmidi (vedi oltre) sia come fimbrie per l'adesività sia come pilo detto sessuale per creare un ponte citoplasmatico tra due cellule batteriche nei processi di coniugazione.

Morfologia delle adesine Afimbrial adhesin Type I fimbriae Type IV fimbriae (= bundle forming pilus) Curli 26

ADESINE BATTERICHE

La Parete (Cell-Wall) E’ lo strato compreso tra la membrana citoplasmatica e la capsula Gram+: peptidoglicano e ac. teicoici Gram-: peptiglicano, lipoproteine, membrana esterna e lipolisaccaride (LPS) Fornisce protezione osmotica (5-20 atm) entra in gioco nella divisione non ha permeabilità selettiva

RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DELLA PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI E NEGATIVI Gram positivi Gram negativi Peptidoglicano Peptidoglicano Membrana Membrana citoplasmatica Una parete rigida è presente nei batteri, nei miceti e nella cellule vegetali Nei batteri è più complessa e diversa tra Gram+ e Gram- Polimero: peptidoglicano Funzioni: esoscheletro, bilancio idrico, fisionomia antigene, recettori per i fagi e colicine Periplasma Membrana esterna Lipopolisaccaridi e proteine

PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI Proteina associata alla parete Acido teicoico Acido lipoteicoico Peptidoglicano Intersecati con il peptidoglicano si trovano gli acidi teicoici La parete contiene: acido teicoico e teicuronico (sino al 50%) e polisaccaridi 2 tipi di ac. Teicoico: -ac. teicoico di parete -ac. teicoico di membrana (lipoteicoico), legato ai glicolipidi e concentrato nei mesosomi Acidi teicoici: determinanti antigeni e fibrille di adesione, fissano cationi per enzimi Struttura fibrillare a carica negativa che funge da filtro Acido teicuronico: è sintetizzato al posto dell’acido teicoico quando il fosfato è limitato (ac. N-acetilmansuronico sostituisce l’acido fosforico) Polisaccaridi: Polimeri di mannoso, arabinoso, galattoso, ramnoso, glucosammina…. Membrana citoplasmatica

BATTERIO GRAM NEGATIVO Membrana esterna Membrana citoplasmatica Peptidoglicano

PARETE CELLULARE DEI GRAM NEGATIVI Polisaccaride O-specifico Core polisaccaridico Esterno Lipopolisaccaride (LPS) Porina Lipide A Membrana esterna Membrana citoplasmatica Spazio periplasmico: enzimi in grado di degradare grosse molecole atb e dna fagi peptidoglicano legato a lipoproteine Membrana esterna: consente il passaggio di molecole idrofile 900-1000d Lipopolisaccaride: endotossina Lipoproteine di Brown Sono legate al peptidoglicano ed alla membrana esterna Sono composte de 57 aa con ripetizioni di 15 aa in sequenza Lipoproteina Fosfolipide Periplasma Peptidoglicano Membrana citoplasmastica Interno

Enzimi attivi sulla parete Lisozima, contenuto nella saliva, lacrime e mucosa nasale, Autolisine, contenute negli stessi batteri: glicosidasi, amidasi e peptidasi (enzimi che intervengono sulla sintesi di parete).

Membrana citoplasmatica Costituita da fosfolipidi e proteine, non contiene steroli (negli eucarioti) presenta invaginazioni: i mesosomi importanti nella formazione del setto vi è attaccato il DNA in certe specie su altri mesosomi vi è un sistema di trasporto attivo (fotosintesi, azoto)

Doppio strato fosfolipidico della Membrana Citoplasmatica batterica Lipidi 40% (steroli assenti, fosfolipidi ++) Acidi grassi Regione idrofila Regione idrofobica Aspetto trilaminare 80Å Lipidi 40% proteine 60%, carboidrati pochi Opani svolgono la funzione di stabilizzazione del colesterolo, H2O Glicerolo Fosfato

STRUTTURA DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA Esterno Gruppi idrofilici Fosfolipidi Gruppi idrofobici Interno proteine di norma non glicosilate Molecola fosfolipidica Proteine integrali di membrana

Membrana citoplasmatica Funzioni permeabilità selettiva e trasporto, trasporto elettroni e fosforilasi ossidativa escrezione enzimi idrolitici contiene enzimi e proteine (carrier) deputate alla sintesi del DNA, polimeri della parete, lipidi di membrana contiene recettori e proteine necessarie alla chemiotassi Il 50% della membrana si presenta in uno stato semifluido dovuto alla grande attività per la crescita batterica

FUNZIONI DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA Barriera di permeabilità Previene dispersioni e funziona come centro di transito per il trasporto di nutrienti da e verso la cellula Sito di ancoraggio Siti di molte proteine coinvolte nel trasporto, nelle vie biosintetiche e nella chemiotassi Regola lo scambio dei metaboliti Diversi meccanismi di trasporto: diffusione passiva, trasporto attivo Sede della fosforilazione ossidativa (enzimi catene respiratoria) nei batteri che producono ATP tramite respirazione , sintesi peptidoglicano Mesosomi (+ complessi nei G+): artefatti dei processi di fissazione Produzione dell’energia Enzimi della catena respiratoria Mesosomi ?

Forza motrice protonica: le reazioni biochimiche a livello di MC creano un eccesso di H+ all’esterno (gradiente) che tendono a rientrare. Attraverso ATPasi la cellula genera ATP.

Lo spazio periplasmico E’ compreso tra la membrana interna e quella esterna, è riempito da un gel formato da peptidoglicano idratato. Diffusi nel gel vi sono inoltre proteine ed oligosaccaridi nonché proteine leganti specifici substrati, enzimi come la fosfatasi alcalina che reagendo con substrati li rendono trasportabili all’interno. Molti di questi composti intervengono nella regolazione della pressione osmotica, per esempio, cellule che crescono in ambiente ipotonico aumentano la sintesi di oligosaccaridi.

STRUTTURA DEL LIPOPOLISACCARIDE DEI BATTERI GRAM NEGATIVI Polisaccaride O-specifico Core polisaccaridico Lipide “A” Acidi grassi saturi Lipopolisaccaride (endotossina) È costituito da 3 parti: -lipide A  responsabile della tossicità (glucosammina fosforilata esterificata con acidi grassi di ancoraggio alla m. esterna) -core polisaccaridico  polisaccaride ramificato 9-12 zuccheri (identico nei membri di una stessa specie): 2 zuccheri peculiari eptoso e keto-deossi-octonico -antigene O  lungo polisaccaride lineare (5-100 unità, 3-5 zuccheri/unità), protrude fuori dal batterio (sierotipi)

Struttura UNITA’ BASALE N-acetilglucosamina (G) Acido N-acetilmuramico (M) (1-6) Gruppo N-acetile Legame sensibile Al lisozima Peptidoglicano polimero formato dalla ripetizione di sub-unità peculiari della cellula batterica Sub-unità: N-acetilG + acido MUR Legati fra di loro mediante legame  1-6 Al gruppo carbossilico dell’acido MUR sono legate corte catene di aa (D-ala e acido meso-diaminopimelico) Legame  1-4 unisce l’acido MUR di una unità alla N-acetilG dell’unità successiva (LISOZIMA) I polimeri lineari sono connessi fra loro direttamente ( Gram-) o da ponti di pentaglicina (Gram+) aa in posizione 3 e 4 intervengono nel legame crociato Legami peptidici L-alanina Acido D-glutammico D-alanina Acido Meso diaminopimelico

LEGAME TRA LE UNITA’ PEPTIDICHE E GLICANICHE NELLA FORMAZIONE DELLO STRATO DI PEPTIDOGLICANO Scheletro del glicano Peptidi Escherichia coli (Gram negativo) Staphylococcus aureus (Gram positivo)

Sistemi di secrezione (Gram-negativi) sono NOTI SEI SISTEMI di esportazione di molecole effettrici nella membrana e citoplasma della cellula ospite della quale modulano ed alterano le funzioni per favorire la propria sopravvivenza e replicazione nei tessuti dell.ospite (49, 100, 293). L.energia necessaria per il trasporto del substrato è fornita da ATP per azione di ATPasi (tranne che nel sistema IV) situata nella faccia interna della membrana citoplasmica. Alla secrezione di molte proteine batteriche partecipano delle chaperonine che legano il substrato, ne impediscono la degradazione e ne orientano il passaggio attraverso i vari sistemi (5).

Sistemi di secrezione (Gram-negativi) Tipo I: la proteina è direttamente liberata nell’ambiente attraverso una porina Complesso trimerico ABC (ADP binding cassette) .one-step., cioè senza modifiche o clivaggi a livello del periplasma, composto dal trasportatore ABC. La sequenza segnale è presente nel termine C della proteina secreta. Esempio: (HlyB) + fattore accessorio (HlyD) + fattore addizionale della membrana esterna (Tol C). È responsabile della secrezione dell.emolisina HlyA dell.E. coli, dell.adenilato ciclasi (B. pertussis), leucotossina (P. haemolytica) proteasi (P. aeruginosa), e di altre tossine (107).

Sistemi di secrezione (Gram-negativi) Tipo II: la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi un vettore la porta all’esternoSistema (.two-step.) in cui avviene prima clivaggio della sequenza leader poi il passaggio, attraverso la membrana interna tramite sistema sec e/o GSP (General Secretory pathway), nel periplasma, quindi trasporto della proteina matura (troncata al termine .N) nella membrana esterna mediato da 12 proteine presenti nella membrana interna (alcune simili a proteine dei pili tipo IV ed all.apparato .export. di batteriofagi filamentosi ed alla proteina secretina del sistema III). Il canale di passaggio è proporzionato alle dimensioni delle molecole (proteasi, lipasi, fosfo lipasi, cellulasi, pectinasi) o tossine da esportare, come la 10 tossina colerica (CTx), pullulanasi di K. oxytoca, aerolisina di A. hydrophila, e tossine di diverse specie patogene appartenenti alla famiglie delle Legionelle, Enterobatteriacee, Pseudomonadacee (5).

Sistemi di secrezione (Gram-negativi) TipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente con un meccanismo tipo siringa TIPO III: Sistema (.one step.) composto da un complesso di oltre 20 proteine che si assemblano in un canale altamente regolato che attraversa la membrana interna, il periplasma e la membrana esterna, a guisa di siringa munita di relativo ago da iniezione che penetra nella membrana della cellula bersaglio. Visibile al microscopio elettronico come struttura similflagellare con corpo conformato a dischi sovrapposti e l.ago di varia lunghezza a seconda della specie batterica (ad es., 50-588 nm. nei coli EPEC, molto più corto nelle shigelle) (296bis). Questo sistema è usato da numerosi batteri, come: Salmonelle, Shigelle, Yersinie, E. coli EPEC e EHEC, Legionelle, Vibrioni, Aeromonas, Chlamydia spp, B. bronchiseptica, Pseudomonas aeruginosa, Erwinia (18, 37, 100, 148, 293, 294, 296bis, 353, 354). Il sistema delle Salmonelle è codificato da tre isole cromosomiche di patogenicità (Quadro3). Nelle Shigelle i geni codificanti il sistema III sono situati invece in un plasmide di 220 Kb.

Sistemi di secrezione (Gram-negativi) TipoIV: il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula mediante un ponte citoplasmatico (donatore e ricevente) Sistema (.two-step.) composto da circa 30 proteine (descritto prima per le IgA-1 proteasi e poi per varie adesine, invasine e tossine, fattori di motilità, siero-resistenza). È un Sistema di autotrasporto: Come funziona? 1) Viene sintetizzata una poliproteina (precursore) che poi è esportata con apparato .sec. 2) Clivaggio della sequenza leader della poliproteina da peptidasi sulla membrana citoplasmica 3) Liberazione nel periplasma della proteina matura 4) Il dominio β (poro) si inserisce nella membrana esterna ! struttura .β Barrel. o foro (conformazione proteica complessa composta da foglietti β multipli antiparalleli con due superfici amfipatiche, una idrofila e una idrofobica) 5) Traslocazione del dominio attraverso il canale verso l.esterno con clivaggio proteolitico e liberazione della proteina matura (ad es.: IgA-1 proteasi) Perché è definito .autotrasportatore.? Perché il passaggio della proteina nell.OMP (outer membrane protein) è mediato dal suo Ctermine senza bisogno di energia e di fattori accessori per il processo di traslocazione. Impiegato per la secrezione di proteine (tossine) o complessi proteine-DNA con comuni sequenze aminoacidiche nei domìni N- e C-terminali e H (o passeggero) da numerosi batteri: - Rickettsia spp. (rOmpA, B, SipT) - B. pertussis (BrkA), B. parapertussis (pertactina P70), B. bronchiseptica (TcfA), N.gonorrhoeae e meningitidis (IgA-1 proteasi) - E. coli (AIDA-1, Ag13, Esp C, Esp P, Pet, Tsh), S. flexneri (sepA, ShMu, IcsA), Serratia marcescens (Ssp, Ssp-h1, Ssp-h2), H. influenzae (IgA-1 proteasi, Hap, Hia, Hsf), Moraxella catarrhalis (UspA-1, UspA-2) - Helicobacter pylori (VacA, CagA), H. mustelae (Hsr) - L. pneum

Sistemi di secrezione (Gram-negativi) Tipo V: la proteina è portata all’esterno mediante se stessa (autotrasporto) TIPO V: simile al tipo II in quanto usa il sistema di esportazione di tossine sec-dipendente per raggiungere il periplasma ma non abbisogna di proteine accessorie come il II e si comporta quindi da sistema autotrasportatore come il sistema IV. Usato da: B. pertussis (FHA-B), H. influenzae (proteine ad alto PM o HMVs), H. ducreyi (adesina LspA), - P. mirabilis (emolisina Hpm).

Sistemi di secrezione (Gram-negativi) Tipo I: la proteina è direttamente liberata nell’ambiente attraverso una porina Tipo II: la proteina viene immessa nello spazio periplasmico quindi un vettore la porta all’esterno TipoIII: la proteina è introdotta nella cellula bersaglio direttamente con un meccanismo tipo siringa TipoIV: il prodotto è inserito in un altro microorganismo o cellula mediante un ponte citoplasmatico (donatore e ricevente) Tipo V: la proteina è portata all’esterno mediante se stessa (autotrasporto)

Sistemi di secrezione (Gram-positivi) Le proteine elaborate nel citoplasma sono trasferite a livello di membrana citoplasmatica qui alcune proteine vettore (chaperone) mediano il passaggio attraverso la parete durante il quale la proteina si trasforma nella versione funzionale con meccanismo non noto

FUNZIONI DEL CROMOSOMA Il cromosoma consiste di circa 3,8-4,5 milioni di basi appaiate, esso è diviso funzionalmente in segmenti, ciascuno dei quali determina una sequenza di aminoacidi e quindi la struttura di una proteina. Queste proteine, enzimi, componenti della membrana ecc. costituiscono le proprietà del microrganismo. Un segmento di DNA che determina un prodotto funzionale è chiamato gene. Gli eventi attraverso i quali una sequenza di nucleotidi di un gene determina una proteina sono i seguenti:

L’enzima RNApolimerasi, usando il DNA come modello, forma una singola catena poliribonucleotidica chiamata RNA messaggero (mRNA). Questo processo è noto come trascrizione. Questo mRNA ha una sequenza nucleotidica che è complementare con una delle catene della doppia elica di DNA.

Gli aminoacidi sono attivati enzimaticamente e trasferiti ad una molecola particolare di RNA chiamato RNA transfer (tRNA). Questi tRNA hanno una struttura che presenta ad una estremità una tripletta di basi sul mRNA, ed all’altra estremità hanno legato l’aminoacido corrispondente. La tripletta posta sul mRNA si chiama codon.

mRNA ed il tRNA vanno insieme sulla superficie del ribosoma mRNA ed il tRNA vanno insieme sulla superficie del ribosoma. Il tRNA trova la tripletta complementare sul mRNA. Il ribosoma si muove sul mRNA e la sintesi procede. Il processo è noto come traduzione.

Diffusione della resistenza agli antibiotici PLASMIDI I plasmidi sono piccoli elementi di DNA circolare che si replicano autonomamente (replicon, fattori R, elementi genetici extracromosomici, geni aggiunti, episomi, profagi non integrati). Codificano per funzioni non indispensabili per la cellula, ma che possono essere fondamentali in particolari ambienti. Diffusione della resistenza agli antibiotici

PLASMIDI Elementi genetici extracromosomici DNA circolare, doppia elica replicazione autonoma ( da 1.5 a 400 Kb 1-1,5 Kb = 1 gene 4500 Kb = cromosoma 1 Mdal = 1 milione dalt = 3 Kb 1ųm = 2 Mdal

PLASMIDI Classificazione Fenotipo Numero di copie Peso molecolare Frammenti di restrizione Gruppo di compatibilità Genetico e biochimico Fattori R coniugativi e non Amplificazione dei geni Batteriocine

ENDOSPORE Diversi microorganismi (gram+), quando le condizioni ambientali diventano sfavorevoli, sono in grado di formare endospore (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina ecc.) che poi sono liberate nell’ambiente. La spora è una cellula in fase di riposo, altamente resistente al calore, all’essiccamento, e agenti chimici, quando le condizioni risultano nuovamente favorevoli la spora germina e produce una cellula vegetativa.

Sporulazione La sporulazione comporta la produzione di nuove strutture, enzimi e metaboliti. Circa 200 geni strutturali sono attivati durante il processo. Inizia con una invaginazione della MC sino a racchiudere il nucleo. La prespora si trova così racchiusa tra due membrane capaci di sintetizzare parete nella parte compresa tra loro. La prima struttura che appare si chiama corteccia, con internamente la parete della spora, all’esterno delle due membrane si costituisce la tunica sporale (mantello), ed oltre la tunica l’esosporio. Tutto richiede una gran quantità di calcio e sintesi di ac. dipicolinico. All’interno ove è contenuto il nucleo (core), gli enzimi vegetativi sono degradati e rimpiazzati da costituenti della spora.

STADI DI FORMAZIONE DELL’ENDOSPORA 7-10h Stadio 7 Stadio 0 Parete Esosporio Membrana citoplasmatica Cellula vegetativa Core Spora libera DNA Stadio 6 Stadio 1 Strati corticali Stadio 2 Stadio 5 Morfogenesi della spora: Addensamento materiale nucleare a sbarra Divisione nucleare e separazione del materiale nucleare Setto di membrana separa citoplasma a DNA Deposizione involucri esterni ed esosporio Liberazione dallo sporangio Durata processo: 6-10 ore Spora in via di sviluppo Core Nucleo centrale Membrana esterna della spora Stadio 3 Stadio 4 Disidratazione Membrana interna della spora Esosporio Corteccia iniziale

Proprietà Core: contiene il nucleo, tutti i componenti della sintesi proteica ed un sistema per generare energia basato sulla glicolisi. L’energia per la germinazione è conservata in 3-fosfoglicerato piuttosto che ATP. La resistenza è dovuta in parte allo stato disidratato e alla presenza nel core di dipicolinato di calcio (intermedio nella sintesi della lisina)

Proprietà Parete della spora E’ lo strato più interno di parete che circonda la MI della spora, composta di peptidoglicano (diventerà parete nella cellula quando germinerà)

Proprietà Cortex E’ lo strato più spesso dell’involucro della spora, contiene peptidoglicano ma con meno legami crociati di quello usuale. Sensibile al lisozima, la sua autolisi è importante durante la germinazione.

Proprietà Mantello E’ composto da proteine di tipo cheratinoso aventi molti legami disolfuro. Impermeabile agli agenti chimici.

Proprietà Esosporio Lipoproteina contenente alcuni carboidrati.

Fisiologia della spora Nessun consumo di O2 Attività enzimatiche assenti Assenza di sintesi macromolecolari Resistenti agli UV e all’essiccazione Termoresistenza: stabilità proteine (particolare stabilizzazione della struttura 2aria e 3aria), Ca, acido dipicolinico  problema sterilizzazione Possono sopravvivere per decine di anni

GERMINAZIONE Avviene in tre stadi: attivazione, iniziazione e crescita. Attivazione Anche se posta in ambienti favorevoli la spora non germina se non vi è danno al mantello: calore, abrasione, acidità e composti contenenti gruppi sulfidrici liberi. Iniziazione Una volta attivata la spora, la germinazione avviene se certi effettori sono legati (L-alanina, adenosina). Questo mette in azione l’autolisina che degrada il cortex. E’ assunta acqua, è liberato il dipicolinato di calcio e sono degradati gli altri costituenti della spora. Crescita Si osserva un rigonfiamento all’interno (core) e quindi sintesi di nuova parete su quella già presente (parete della spora) con successiva divisione cellulare.

DIFFERENZE PRINCIPALI TRA ENDOSPORA E CELLULA ORIGINARIA Morfologia e dimensioni Composizione Resistenza agenti chimici e fisici Attività metaboliche Resistenza Inattivazione Batteri non sporigeni 80°C, 5-10 min Sporigeni C. botulinum C. tetani Clostridi gangrena gassosa Bollitura 330 min 90 min 30 min Vapor acqueo 20 min, 121°C, 1 atmosfera Calore secco 90 min, 170°C