UV-VIS Dott. Alfonso Zoleo Laboratorio di Metodologie Spettroscopiche per le Biotecnologie AA 2013-2014

Concetti fondamentali Trasmittanza: T= I /I0  quanta luce è trasmessa Assorbanza: A=log(I0/ I) = log(1/T)  quanta luce è assorbita [c],  I0(l) I(l) l Legge di Lambert-Beer Cammino ottico (in cm) Concentrazione (in mol l-1) Al = assorbanza el = assorbività molare o coefficiente di estinzione molare (in M-1 cm-1)

HnA Hn-1A- + H+ Hn-1A Hn-2A- + H+ Hn-2A Hn-3A- + H+ Concetti fondamentali Additività delle assorbanze L’assorbanza totale è la somma delle assorbanze delle singole specie Equilibri protici in soluzione HnA Hn-1A- + H+ Hn-1A Hn-2A- + H+ Hn-2A Hn-3A- + H+ Molte sostanze organiche e biologiche contengono eteroatomi (N,O,..) e possono protonarsi e deprotonarsi: lo spettro UV-VIS è spesso la somma degli spettri risultanti dalle diverse specie!

acido basico Concetti fondamentali Come conseguenza degli equilibri protici, lo spettro UV-VIS di un colorante in acqua dipende spesso dal pH acido basico Fluoresceina in soluzione acquosa a vari pH

K2 K1 K3 Concetti fondamentali La fluoresceina è presente in quattro forme protiche - K2 K1 K3 H + -

Concetti fondamentali - H + Il dianione della fluoresceina è la specie con l’assorbività più alta, con un massimo a 490 nm

Conviene avere in soluzione la sola specie dianionica Concetti fondamentali Conviene avere in soluzione la sola specie dianionica H3F+ H2F + H+ H2F HF- + H+ HF- F2- + H+ Imponiamo la condizione: ( il 99% in forma dianionica) pH>8.43

Si parte da una soluzione madre 1 mM di fluoresceina In laboratorio Scopo dell’esperienza: determinazione dell’assorbività molare in acqua a 490 nm della fluoresceina dianione Ogni gruppo deve preparare 5 soluzioni a differenti concentrazioni fra 20 mM e 2 mM Si parte da una soluzione madre 1 mM di fluoresceina Ogni gruppo prepara una soluzione 20 mM a partire dalla soluzione madre. La soluzione va portata a pH=10 con NaOH 0,1 M 1 ml di sol. 1 mM + 5 ml di NaOH 0,1 M diluiti a 50 ml 1 ml 50 ml 50 ml

Sulla soluzione più diluita si effettua una misura di fluorescenza In laboratorio 10 ml 10 ml 10 ml Ogni gruppo dispone di tre matracci da 10 ml e due pipette tarate da 3 e 5 ml. Con questa attrezzatura prepara tre soluzioni a partire dalla soluzione 20 mM : 1) 8 ml di soluzione 20 mM + 0.5 ml di NaOH 0.1 M in 10 ml 2) 5 ml di soluzione 20 mM + 0.5 ml di NaOH 0.1 M in 10 ml 3) 3 ml di soluzione 20 mM + 0.5 ml di NaOH 0.1 M in 10 ml Si effettuano 4 misure di assorbanza: delle soluzioni 1), 2) e 3) e della soluzione madre da 20 mM. Si svuota il matraccio della soluzione 2) e si usa per preparare la soluzione 4: 5 ml di soluzione 3) + 0.5 ml di NaOH 0.1 M diluiti a 10 ml. Sulla soluzione più diluita si effettua una misura di fluorescenza

In laboratorio Elaborazione A A=e b C C Le assorbanze a 490 nm sono diagrammate contro le relative concentrazioni A (A0,C0) (A1,C1) (A2,C2) A=e b C (A3,C3) (A4,C4) C Dal fitting dei punti si ricava la pendenza e l’errore relativo: Dalla pendenza, noto il cammino ottico (1 cm) si ricava l’assorbività molare a 490 nm. Indicare l’errore sull’assorbività.

Relazione Ogni gruppo deve presentare una relazione sulle misure UV-VIS La relazione deve essere essenziale: Max. una paginetta di introduzione con le basi e l’obiettivo del lavoro Max 2 pagine di parte sperimentale